糖基化終產物對人血管內皮細胞基質金屬蛋白酶－2表達和活性的影響

劉 勇 張 寰 顧秀峰 李煥明 劉乃豐 (天津市第四中心醫院，天津 30040)

糖尿病患者易患動脈粥樣硬化，持久的高血糖狀態最終形成具有高度活性的糖基化終產物(AGEs)，而AGEs在動脈粥樣硬化的發生、發展中起重要作用。同時，在動脈粥樣硬化形成過程中，基質金屬蛋白酶(MMPs)扮演了重要的角色，其中MMP－2(明膠酶A)與動脈粥樣硬化的關系越來越引起人們關注。在動脈粥樣硬化及經皮冠狀動脈血管成形術后再狹窄病灶中，MMP－2表達明顯增多，血管壁中的內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞都可表達并分泌 MMP－2〔1，2〕。AGEs可能通過作用于血管內皮細胞調控MMP－2的表達和活性，從而影響糖尿病患者動脈粥樣硬化的進展。本研究從AGEs對MMP－2表達影響這一角度，探討其對動脈粥樣硬化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人血管內皮細胞株ECV304(上海細胞生物研究所)，牛血清白蛋白(BSA，Amresco公司)，D－葡萄糖(重慶北培化學試劑廠)，M199培養基(低糖，GIBCO公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Hepes(Amresco公司)，明膠(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 AGE－BSA的制備 在pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入BSA及D－葡萄糖(BSA終濃度為5.0 g/L，葡萄糖終濃度為50 mmol/L)，過濾除菌后37℃無菌孵育12 w。對照組BSA不含葡萄糖。

1.2.2 人血管內皮細胞的培養 于37℃，5%CO2培養箱內，以20%小牛血清的M199培養基中培養ECV304細胞，后以0.125%胰蛋白酶消化細胞，調節細胞密度至2×106個/ml，接種于6孔板，2 ml/孔中，繼續培養72 h后更換無血清培養基培養24 h，然后分兩組，每組均設對照組(Control)及BSA組，兩組均不含葡萄糖。第1組加入葡萄糖濃度為50 mmol/L孵育的不同濃度的 AGE－BSA(50、100、200、400 mg/L)分別干預24 h。第2組加入葡萄糖濃度為50 mmol/L孵育的AGE－BSA(濃度為200 mg/L) 分別干預 0、12、24、36、48 h 和 72 h。

1.2.3 內皮細胞總RNA的提取 取干預好的細胞，留取上清，直接于6孔培養板中提取內皮細胞總RNA。用4℃PBS洗滌細胞3次，每孔加入1 ml Trizol，然后分別以氯仿、異丙醇和無RNA酶75%乙醇提取內皮細胞總RNA。用核酸蛋白測定儀測光密度OD260/OD280均在1.7以上，說明RNA純度較高。

1.2.4 逆轉錄聚合酶鏈反應 MMP－2引物依據 McKenna等〔3〕報道的序列，β－肌動蛋白(β－actin)(內參照)引物依據Izumi等〔4〕報道的序列并與基因庫(GenBank)上下載的mRNA序列核對無誤，均由上海生工生物工程公司合成。MMP－2引物序列:上游5′－CAGGCTCTTCTCCTTTCACAAC－3′，下游5′－AAGCCACGGCTTGGTTTTCCTC－3′，擴增產物長度為 398 bp。β－actin引物序列:上游 5′－GGTCAGAAGGATTCCTATGTG－3′，下游 5′－ATTGCCAATGGTGATGACCTG－3′，擴增產物長度為 615 bp。以2 μg總 RNA為模板，加入 Oligo(DT)18、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、逆轉錄酶(M－MLV)5 × 緩沖液、dNTP、RNasin，總反應體系25 μl，進行逆轉錄。PCR反應體系及反應條件:cDNA、10 × 緩沖液、MgCl2、dNTP、MMP－2 引物、β－actin 引物、Taq DNA聚合酶，總反應體系50 μl。PCR反應條件:94℃ 2 min，然后94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min 進行30 次循環擴增，72℃延伸8 min。取6 μl PCR產物與1 μl上樣緩沖液混合后上樣于1.7%瓊脂糖凝膠，同時以5 μl 100 bp DNA分子質量標記點樣，以0.5×Tris鹽溶液(TBE)為緩沖液電泳，用Image Master VDS掃描分析儀掃描凝膠，以β－actin為內參照，用Total Lab分析軟件對RT－PCR結果進行吸光度分析，并對PCR產物進行測序(上海申友生物技術有限責任公司)，與GenBank查到的序列對照，核對無誤，進一步證實了PCR產物的正確。

1.2.5 明膠酶圖檢測 MMP－2活性 配制10%分層膠(含0.2%明膠，56℃助溶)、5%濃縮膠。取不同條件刺激的細胞培養液20 μl上樣，以恒壓 200 V，電泳 45～50 min。凝膠經2.5%Triton X－100漂洗2次，每次10 min，于反應緩沖液〔Tris－HCl 50 mmol/L(pH7.4～7.6);NaCl 50 mmol/L;CaCl210 mmol/L;1%Triton X－100〕中37℃孵育過夜，0.5%考馬斯亮藍R－250(0.5%考馬斯亮藍R－250;45%甲醇;10%乙酸)染色3 h，脫色液(40%甲醇;10%乙酸)脫色至藍色背景下白色條帶清晰可見。明膠酶圖結果用Gel－pro32 Analyzer軟件進行光密度分析。

1.3 統計學方法 應用Prism3.0統計軟件進行分析，數據資料以±s表示，采用 One－Way ANOVA，組間比較采用 Newman－Keuls方法。

2 結果

2.1 RT－PCR法分析AGEs調控MMP－2表達的濃度效應 干預24 h后 Control組 ECV304細胞表達一定量的 MMP－2(0.225±0.024);與 Control組相比，BSA 組對MMP－2的 mRNA表達(0.241±0.041)無影響(P＞0.05);與BSA組比較，AGEBSA各濃度組 MMP－2的表達水平均明顯升高(50、100、200、400 mg/L組 MMP－2 mRNA 表達量分別為 0.570±0.020，0.689±0.027，0.882±0.058，0.863±0.031)，差異顯著(P ＜0.01)，其中AGE－BSA的濃度為200 mg/L調控 MMP－2的表達效應最佳，見圖1。

2.2 RT－PCR法分析AGEs調控MMP－2表達的時間效應 與Control組相比，BSA組對MMP－2的mRNA表達無影響，無明顯差異(P＞0.05);與BSA組相比較，AGE－BSA各時間組 MMP－2的表達均明顯升高(0、12、24、36、48、72 h MMP－2 mRNA 表達水平分別為0.180±0.025，0.304±0.036，0.677±0.029，0.622±0.018，0.582±0.027，0.561±0.016)，差異有統計學意義(P ＜0.01)，其中在12 h時已經升高，24 h時達到最高(P＜0.01)，以后仍維持較高水平。見圖2。

2.3 明膠法分析AGEs調控ECV304細胞MMP－2表達后對其活性的影響 對照組及不同濃度給藥組(干預24 h)的培養上清均可在72 kD的位置使明膠發生降解。與 Control組(3.131±0.367)相比，BSA組(3.632±0.730)誘導 ECV304細胞MMP－2表達后對其活性無明顯影響，降解明膠無明顯差異(P＞0.05);與BSA組相比較，AGE－BSA不同濃度給藥組誘導ECV304細胞 MMP－2表達后均能升高其活性(50、100、200 mg/L組 MMP－2 mRNA表達量分別為 6.853±1.017，9.012±1.518，11.968±1.341)，降解明膠逐漸增強(P ＜0.01)。見圖3。

圖1 不同濃度的AGE-BSA干預ECV304細胞24 h時MMP-2 mRNA的表達

圖2 相同濃度的AGE-BSA干預ECV304細胞不同時間點MMP-2 mRNA表達

圖3 AGEs調控ECV304細胞MMP-2表達后對其活性的影響

3 討論

糖尿病血管并發癥是最常見的也是最嚴重的并發癥之一。持久的高血糖狀態會導致體內蛋白質、脂質等糖基化，經過一系列非酶促反應，最終形成具有高度活性的AGEs。目前的研究表明動脈粥樣硬化病灶中可檢測出AGE，在糖尿病及冠心病人血清中AGE濃度亦明顯升高〔5〕，而且AGE能夠增強大鼠主動脈血管平滑肌細胞、單核細胞趨化蛋白1基因和MMP－2的表達，抑制人血管內皮細胞過氧化體增殖物激活型受體γ基因的表達〔6〕。本研究前期的動物實驗已經表明糖尿病小鼠血清AGE水平顯著增高，而且隨糖尿病病程的遷延，其增高的水平越來越明顯〔7〕。提示AGE可能通過誘導MMP－2的表達參與糖尿病后血管病變。

本研究表明細胞外基質與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關，降解細胞外基質的酶主要是MMPs，而MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，可分為四大類，即膠原酶、明膠酶、基質水解酶和膜型－MMPs(MT－MMPs)。其中MMP－2在血管壁中的平滑肌細胞、巨噬細胞、內皮細胞上均有表達。在糖尿病患者、急性冠狀動脈綜合征患者以及患有糖尿病的急性冠狀動脈綜合征患者中 MMP－2 水平升高〔8〕。Hoffmann 等〔9〕的研究表明，AGE刺激培養的脈絡膜內皮細胞MMP－2的表達增加。本實驗結果表明，AGE－BSA能夠誘導人血管內皮細胞MMP－2表達，并增強其降解明膠活性，且這種效應具有時間和濃度依賴性。糖基化與氧化應激密切相連，蛋白質發生非酶糖化時也有氧自由基的產生，糖化脂蛋白容易發生過氧化，AGEs即氧化糖基化的不可逆產物。氧化應激在糖尿病并發癥發生發展中起重要作用，而MMP－2對氧化應激很敏感。最近Kowluru等〔10〕在研究糖尿病視網膜病變的發展中發現，高糖可以促進糖尿病大鼠視網膜內皮細胞MMP－2表達增加、活性增強，而抗氧化應激可以抑制MMP－2的表達。因此，推測AGEs可能通過降低超氧化物歧化酶的活性，使細胞內氧化應激增加，MMP－2表達增加，活性增強，參與了糖尿病后血管動脈粥樣硬化的進程。深入研究AGEs與MMP－2之間的相互作用，將為深入了解糖尿病易患動脈粥樣硬化的機制及其合理防治提供新思路。

1 Faia KL，Davis WP，Marone AJ，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis:correlation with in－situ zymography〔J〕.Atherosclerosis，2002;160(2):325－37.

2 Hojo Y，Ikeda U，Katsuki T，et al.Matrix metalloproteinase expression in the coronary circulation induced by coronary angioplasty〔J〕.Atherosclerosis，2002;161(1):185－92.

3 McKenna GJ，Chen Y，Smith RM，et al.Arole for matrix metalloproteinases and tumor host interaction in hepatocellular carcinomas〔J〕.Am J Surg，2002;183(5):588－94.

4 Izumi S，Hirai K，Miyamasu M，et al.Expression and regulation of monocyte chemoattractant protein－1 by human eosinophils〔J〕.Eur J Immunol，1997;27(4):816－24.

5 劉乃豐，孫子林，童嘉毅，等.冠心病患者血清糖基化終產物水平升高的意義〔J〕. 中華心血管病雜志，2001;29(2):94－6.

6 顧秀峰，劉 勇，劉乃豐.糖基化終產物對大鼠主動脈平滑肌細胞MMP－2 表達的影響〔J〕. 天津醫藥，2006;34(12):871－4.

7 孫子林，劉乃豐，孫桂菊，等.糖尿病小鼠血清糖基化終產物水平增高〔J〕. 中國糖尿病雜志，2000;8(5):315，320.

8 Derosa G，D′Angelo A，Scalise F，et al.Comparison between metalloproteinases－2 and －9 in healthy subjects，diabetics，and subjects with acute coronary syndrome〔J〕.Heart Vessels，2007;22(6):361－70.

9 Hoffmann S，Friedrichs U，Eichler W，et al.Advanced glycation end products induce choroidal endothelial cell proliferation，matrix metalloproteinase－2 and VEGF upregulation in vitro〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2002;240(12):996－1002.

10 Kowluru RA，Kanwar M.Oxidative stress and the development of diabetic retinopathy:contributory role of matrix metalloproteinase－2〔J〕.Free Radic Biol Med，2009;46(12):1677－85.