地衣芽孢桿菌轉化間二硝基苯為間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺的研究

呂長維，陶黎明，徐文平

(1.上海師范大學生命與環境科學學院,上海 200234；2.華東理工大學藥學院,上海 200237)

間二硝基苯的還原產物間苯二胺、間硝基苯胺都是重要的中間體，廣泛應用于精細化工、制藥、染料以及農藥工業；而且由間苯二胺與苯二甲酰氯合成的耐高溫芳香聚酰胺樹脂和阻燃纖維具有許多特殊用途(如用于防護服、航空航天材料等[1])，因此需求量大增。目前工業化生產芳香胺主要是利用有機合成中的一個重要單元反應——芳香族硝基化合物的還原反應，實際生產中已有許多經典的方法，例如鐵粉還原、堿性條件下用磺化物還原、水合肼還原、電解還原以及催化加氫還原等等[2,3]，然而這些方法的反應過程需要高壓、易燃氫氣、有害溶劑或會發生重金屬中毒等[4,5]。因此，高效安全地制備芳香胺依然是有機合成中的一個重要研究方向。

生物催化技術具有反應條件溫和、專一性強等特點，受到越來越多的關注，并已廣泛應用于制藥和精細化工領域。已有許多文獻報道了微生物降解環境中芳香族硝基化合物的研究[6,7]。Soojhawon等[8]利用AcinetobacterjuniiA8將對硝基苯酚、對硝基苯胺、對硝基甲苯、間硝基甲苯和2,4,6-三硝基甲苯等化合物在有氧條件下進行生物轉化，最終降解為直鏈化合物。Li等[9]則利用啤酒酵母制備芳基羥胺，反應底物主要包括對二硝基苯、鄰二硝基苯、對甲磺基硝基苯等。但迄今未見利用微生物對間二硝基苯進行轉化的報道。

在篩選具有還原芳香族硝基化合物能力的微生物的過程中，發現了一批細菌和放線菌具有還原硝基的能力，特別是1株地衣芽孢桿菌CGMCC2280，可以以間二硝基苯為底物進行生物轉化。作者在此對轉化產物的分離、鑒定、轉化影響因素和轉化機制進行了研究。

1 實驗

1.1 試劑和培養基

間硝基苯胺(純度≥98%)、間苯二胺(純度≥98%)，美國Aldrich公司；鄰二硝基苯(純度≥98%)，東京化成工業株式會社；鄰硝基苯胺(純度≥98.5%)，上海國藥集團化學試劑公司；間二硝基苯、間硝基苯羥胺、對二硝基苯、對硝基苯胺，純度≥98%，常熟華泰化工廠；液相用甲醇、乙腈，色譜純，美國Merck公司；葡萄糖、蔗糖，市售分析純。

分離培養基Ⅰ(%)：葡萄糖1，酵母提取物0.5，可溶性淀粉2，碳酸鈣 1，N-amine 0.5，稀釋5倍后使用。

分離培養基Ⅱ(%)：可溶性淀粉0.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.1，酵母膏0.1，牛肉膏0.1。

發酵培養基(g·L-1)：酵母浸膏10，蛋白胨10，氯化鈉10，氯化鈷0.005，磷酸氫二鉀0.05，氯化鎂0.005。

1.2 菌株的篩選和鑒定

將采集的土壤樣品用水稀釋后，涂布于分離培養基Ⅰ，28 ℃培養7 d后，挑選各單菌落分別培養于分離培養基Ⅱ。將配制好的間二硝基苯水溶液(200 mg·L-1)在100 ℃消毒20 min后，加入到預先配制并消毒的分離培養基Ⅱ中，使間二硝基苯終濃度為20 mg·L-1，倒入預先消毒的平皿中，待冷卻凝固后，將上述分離的不同的菌種接種于平皿中。培養皿在暗室中37 ℃放置48 h。然后在每個平皿中分別加入13 mL 0.21%的三氯乙酸溶液和0.007%的亞硝酸鈉溶液，室溫放置20 min。再加入1 mL 0.5%的氨基磺酸銨溶液，室溫下保溫3 min。最后在每個平皿中加入5 mL 0.1%的N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液，室溫下仔細觀察平皿中的菌落，將染上紫紅色的菌株作為下一步復篩的備選菌[10]。

陽性菌株B.licheniformisCGMCC2280的培養特征、生理生化特征鑒定根據伯杰氏細菌鑒定手冊[11]進行。DNA提取及16S rDNA的擴增和測序按文獻[12]方法進行，將所測的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的已有序列進行分析比較，確定菌株的分類。

1.3 菌株的培養

將上述染色陽性菌株B.licheniformisCGMCC2280接種于LB培養基上，28 ℃培養2 d，將培養好的菌種接種到已消毒的發酵培養基中，250 mL搖瓶裝量50 mL，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養30 h左右。離心收集菌體，用磷酸緩沖溶液(50 mmol·L-1Na2HPO4/KH2PO4，pH值8.0)洗滌2次，然后用10 mL緩沖溶液混合均勻得靜息細胞懸浮液，供生物轉化用。

1.4 生物轉化

先將過量的間二硝基苯結晶加入磷酸緩沖溶液中使其飽和。在100 mL錐形瓶中加入20 mL上述飽和緩沖溶液和0.5 g葡萄糖，攪拌溶解后再加入5 mL靜息細胞懸浮液，在30 ℃下220 r·min-1搖床振蕩轉化20 h，離心(1000×g，15 min)除去菌體，上清液用于HPLC分析。同時設定無底物對照和無菌空白對照。

在轉化反應時間進程實驗中，在指定的時間取樣0.1 mL,同樣處理后進行HPLC分析。

在碳源影響實驗中，以不加葡萄糖為空白對照，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖代替葡萄糖。以3次獨立實驗(每個實驗至少3個重復)的平均值為實驗值。

1.5 HPLC分析

底物和產物的濃度測定采用HPLC法。

Agilent 1100型液相色譜儀，色譜條件：反相色譜柱(ODS C18,2.5 mm×20 mm,0.5 μm)，流動相為甲醇-乙腈-水混合液(35∶15∶50，體積比)，流速1 mL·min-1，檢測波長235 nm，進樣量20 μL。

1.6 中間體和產物的大量制備

將B.licheniformisCGMCC2280斜面菌種接種于裝有300 mL已消毒LB培養基的1 L搖瓶中，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養20 h，接種到裝有10 L發酵培養基的自動發酵罐(BIOSTAT?C，B.Braun International，Germany)中，37 ℃下通氣(1∶0.4，體積比)攪拌(400 r·min-1)培養24 h。發酵液用自動冷凍離心機(20PR-52D，HITACHI，Japan)離心(1000×g，15 min)后，將菌體懸浮在10 L轉化液(含2%葡萄糖的磷酸緩沖溶液，pH值8.0)中，加入2.5 g間二硝基苯，在14 L自動發酵罐中36～38 ℃攪拌轉化反應。0.5 h后取1 L反應液終止反應，加入1 L氯仿萃取2次，合并萃取液，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮得到固體，用甲醇溶解后進一步用制備型HPLC[Shimadzu LC10A，甲醇-乙腈-水=35∶15∶50(體積比)]純化，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮后得到217 mg化合物A(純度98.2%)。反應2 h后再取1 L反應液，同前操作，得到187 mg化合物B(純度99.4%)。反應24 h后，用2.5 L乙酸乙酯萃取4次，合并有機相，減壓濃縮得到1.27 g近無色固體，在甲醇-苯混合液(5∶1，體積比)中重結晶，得到純度為98%以上的化合物C。

1.7 中間體和產物的結構鑒定

用LC-MS(Agilent LC/MSD)測定中間體和產物的質譜；用NMR(Varian INOVA 400 MHz)測定中間體和產物的氫譜和碳譜。

2 結果與討論

2.1 菌株分離和鑒定

從500株菌中初篩出126株菌落染有紫紅色(表明菌落在生長時可能具有將間二硝基苯還原成間硝基苯胺或間苯二胺的能力)的菌株，再經過液體發酵培養后進一步進行生物轉化實驗，確認19株菌株具有還原間二硝基苯的能力，其中1株菌株具有顯著的還原能力。該菌株菌體呈桿狀，培養36 h左右后產生芽孢，芽孢中生；營養瓊脂平板上，初期菌落呈光滑狀，后期呈列液狀，邊緣毛發褶皺。生理生化實驗表明該菌革蘭氏染色陽性，可水解明膠、淀粉，葡萄糖產酸，甲基紅實驗陽性，可耐受7%的氯化鈉和60 ℃高溫。16S rDNA(GenBank No.EU200968)分析表明，該菌與地衣芽孢桿菌的序列相似度為99%。綜合其形態和生理生化實驗結果判斷該菌株屬于地衣芽孢桿菌CGMCC2280(BacilluslicheniformisCGMCC2280)。

2.2 反應中間體和產物的結構鑒定

LC-MS顯示化合物A分子量為154，1HNMR顯示在苯環上有4個氫，各氫位移值和歸屬為：7.25(1H，s，2-H)，7.46(1H，t,3J4-5=7.91，3J6-5=8.05，5-H)，7.80(1H，d,3J=7.91，4-H)，7.90(1H，d,3J=8.05,6-H)，位于低場的有2個活潑氫。從而推斷化合物A為間硝基苯羥胺。

化合物B和C分別與間硝基苯胺和間苯二胺標準品的保留時間一致；LC-MS分析表明，它們的分子量和碎片峰也與標準品相同，1HNMR數據也一致。從而確定化合物B和C分別為間硝基苯胺和間苯二胺。

各化合物的1HNMR數據見表1。

表1 中間體和產物的1HNMR數據

2.3 底物選擇性

分別以間二硝基苯、間硝基苯胺、鄰二硝基苯、鄰硝基苯胺、對二硝基苯、對硝基苯胺6種化合物作為生物轉化的底物，考察菌株的底物選擇性，結果見表2。

由表2可看出，該菌株優先轉化間位或鄰位二硝基底物，很難轉化對位二硝基底物。

表2 地衣芽孢桿菌對不同硝基化合物的選擇性還原

注：轉化率為被轉化底物的毫摩爾數與加入底物的毫摩爾數之比，用HPLC測定

2.4 pH值和溫度的影響

設定pH值為8.0、溫度為26～42 ℃，每隔2 ℃為一個區間，振蕩反應20 h后，液相測定被轉化的底物量和產物的生成量，考察溫度對轉化率的影響，結果見圖1。設定溫度為37 ℃、pH值為4.5～10.0，振蕩反應20 h后，液相測定被轉化的底物量和產物的生成量，考察pH值對轉化率的影響，結果見圖1。

圖1 pH值和溫度對轉化率的影響

由圖1可看出，該菌株的最適反應pH值為7.5～9.0，最適反應溫度為30～38 ℃。

2.5 糖類的影響

地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉化間二硝基苯反應體系各物質濃度與轉化時間的關系見圖2。

a.加2%葡萄糖 b.未加葡萄糖

由圖2可知，轉化液中添加2%的葡萄糖，有利于地衣芽孢桿菌對間二硝基苯的還原作用。在含有葡萄糖的轉化反應體系中，轉化反應初速度明顯比不加葡萄糖時要快，轉化4 h后產物間苯二胺的濃度仍然不斷增大，但增幅趨緩(圖2a)；在不加葡萄糖的轉化反應體系中，轉化反應初速度較慢，產物間苯二胺的最高濃度較低，尤其是反應14 h后，濃度反而不斷減小(圖2b)。說明間二硝基苯的還原作用需要葡萄糖代謝提供能量和還原力，但該菌在沒有葡萄糖存在的情況下，可直接通過進一步降解產物間苯二胺而維持反應所需的能量。

2.6 溶劑對反應進程及反應產物的影響

研究發現，甲醇、乙醇或丙酮的濃度超過20%時，可徹底終止轉化反應。本實驗以丙酮為反應抑制劑終止轉化反應，在不同時間加入丙硐對轉化反應的影響見表3。

表3 不同時間加入丙酮對轉化反應的影響

注：底物初始濃度1.5 mmol·L-1；轉化率為減少的間二硝基苯毫摩爾數與投入反應的間二硝基苯的毫摩爾數之比，用HPLC測定

由表3可看出，在反應開始時加入丙酮，底物轉化率為1.3%，微量的間硝基苯羥胺可瞬間生成；在反應0.5 h時加入丙酮，底物轉化率為91.3%，中間產物間硝基苯羥胺占91.2%，而間硝基苯胺只占產物的8.8%，無間苯二胺生成；在反應2 h時加入丙酮，底物基本被轉化，轉化率達99.6%，主要產物為間硝基苯胺(占66.4%)，間硝基苯羥胺比例已降至12.1%，而間苯二胺則由0%上升至21.5%；在反應8 h時加入丙酮，主要產物變為間苯二胺(占75.2%)，間硝基苯羥胺比例降至0%，而間硝基苯胺比例也降至24.8%。因此，可以確定地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉化過程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺，如圖3所示。

圖3 地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉化間二硝基苯的生物轉化過程

2.7 討論

目前，關于微生物進行芳香族硝基還原研究的報道主要是集中于環境中芳香硝基化合物的微生物降解，如對三硝基甲苯(TNT)、硝基苯(MNT)以及2,4-二硝基甲苯(DNT)的降解研究[13,14]。Schenzle等[15]利用Ralstoniaeutropha菌產生的3NP硝基還原酶，對2-氯-5-硝基酚進行化學選擇性還原，形成相應的羥胺化合物，并對硝基苯、間二硝基苯、均三硝基苯、13種硝基酚、MNT、DNT和TNT等38種化合物進行了底物適應性比較，發現該酶對2-氨基-4-硝基甲苯的還原活性最高，與NADPH酶的相對活性為219；而對間二硝基苯的相對活性只有12。Li等[9]則利用啤酒酵母將對二硝基苯、鄰二硝基苯、對甲磺基硝基苯等轉化為羥胺，發現產物的比例與酵母的使用量有關，當反應底物濃度為100 mg·(100 mL)-1時，使用5 g干重的酵母可以使對二硝基苯近100%地還原為對硝基苯羥胺和對硝基苯胺，兩者的比例為95∶5，但對間二硝基苯的轉化作用未提及。Li等[16]還利用葡萄皮細胞進行化學選擇性還原芳香族硝基化合物來制備相應的羥胺，進行反應的化合物有8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]吡喃、8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]-N-特丁基異喹啉、8-硝基-1,3-二氧基異吲哚、7-硝基-1,3-二氧基異吲哚、對二硝基苯和2-氰基-4-硝基苯腈，經過6 d的轉化，前4種化合物轉化為羥胺均有較高的轉化率，而對后2種則無轉化效果，對間二硝基苯的轉化作用也未提及。本實驗首次報道了利用地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯來制備間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺的方法。而且根據丙酮對反應的抑制作用原理，通過在不同的反應時間添加丙酮終止反應以控制反應進程，可以得到不同的反應產物，以適應不同的轉化產物要求。根據反應進程可以確定本研究中地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉化過程是先形成間硝基苯羥胺，再進一步形成間硝基苯胺，這一過程與其它芳香胺的形成原理基本一致[7,17～19]。

Blackie等[20]在研究酵母菌還原硝基和亞硝基化合物的過程中，發現反應條件不同可以發生2種不同類型的反應，第一類型的反應中加入糖可促進胺類化合物的生成。Li等[9]在制備芳羥胺的反應體系中也加入了2%的葡萄糖，但并未對葡萄糖的影響作說明。尹萍等[21]篩選了17株能夠降解TNT的酵母和類酵母菌，并發現培養基中加入一定量的碳、氮源可以促進降解。李湛江等[22]利用吉氏擬桿菌和尿擬桿菌與葡萄糖共代謝降解硝基苯，但在不加葡萄糖的情況下降解活性為零，認為這是由于這些菌株不能以硝基苯為唯一碳源的緣故。而本實驗中的地衣芽孢桿菌即使在沒有葡萄糖的情況下，開始也能將底物迅速降解，只是隨后將部分產物降解，以維持菌體活力而導致產物生成率下降。因此，在利用地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉化制備間硝基苯胺，尤其是間苯二胺的時候，需要加入少量的葡萄糖等碳源，以提高轉化率，同時可以避免產物被進一步降解。

根據B.licheniformisCGMCC2280的轉化進程，可以清楚地發現該菌在轉化間二硝基苯的過程中，將間二硝基苯還原為間硝基苯羥胺是一步快速的酶促反應，無論葡萄糖是否加入，都不影響這步反應的進行。但是正如溶劑影響實驗中所揭示的那樣，由于丙酮對細胞間二硝基苯還原酶具有抑制作用，因此在各反應階段加入丙酮等溶劑后，即可終止反應。據此在轉化反應進行0.5 h后加入丙酮溶劑終止反應，可以很方便地得到中間產物間硝基苯羥胺，而不會產生過多的間硝基苯胺和間苯二胺，這也為制備采用化學合成手段難以得到的間硝基苯羥胺提供了一條新的途徑。

Li等[9]認為酵母菌對底物的選擇性與苯環上所連接基團的特性有關，基團吸電性越強，轉化越容易進行；如果是供電子基團則轉化無法進行。但是本實驗結果卻表明底物選擇性與基團的吸電性沒有顯著的相關性，如鄰二硝基苯和對二硝基苯的電子云分布相似，但地衣芽孢桿菌CGMCC2280對兩者的轉化率卻有很大的差別；即使對鄰硝基甲苯這樣有供電子基團的化合物，該菌依然具有很好的轉化活性(數據未列出)。這些結果表明地衣芽孢桿菌CGMCC2280對底物的選擇性主要與化合物的空間結構有關。

3 結論

從土壤中篩選得到1株轉化間二硝基苯的芽孢桿菌，經生理生化實驗及16S rDNA序列分析，確定其為地衣芽孢桿菌CGMCC2280。對含間二硝基苯的菌體轉化液在不同時間取樣，分離純化得到化合物A、B和C，通過LC-MS和1HNMR分析，同時與標準品對照，確定化合物A、B和C分別為間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺。底物特異性表明，該菌對間二硝基苯和鄰二硝基苯的底物轉化率10 h達到98%以上，但對對二硝基苯的底物轉化率卻不到10%。轉化液中葡萄糖具有促進間二硝基苯還原的作用，在沒有葡萄糖存在的情況下，轉化反應速度較慢，且反應后期反應產物間苯二胺會進一步降解。在轉化反應的不同時間加入丙酮終止反應并進行產物分析，發現該菌還原間二硝基苯的轉化過程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺。

(致謝:感謝華東理工大學李忠教授在核磁共振測定方面的幫助!感謝上海南方農藥研究中心陸迪生先生在LC-MS測定中給予的幫助!)

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