大腸桿菌高密度培養研究進展

黎鴻平，黃海嬋，鐘衛鴻

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014)

隨著基因重組技術的不斷發展，越來越多的外源基因得以在微生物中表達，以便大量快捷地獲得外源基因產物或改變微生物的代謝特性。與其它表達系統相比，E.coli表達系統因具有易培養、遺傳學背景清楚、表達水平高、培養周期短等特點，成為目前應用最為廣泛的表達系統。

工業生產發酵的基本目標是以最低的成本獲得最高的細胞或其產物收益，因此大規模高密度培養微生物的技術和工藝變得越來越重要。E.coli的高密度培養技術(HCDC)正是在這樣的一種需求下而發展起來的一門重要技術。E.coli高密度培養是一個相對概念，一般是指E.coli在液體培養時菌體干細胞質量(Dry cell weight，DCW)達50 g·L-1以上時的生長狀態或培養技術。據Riesenberg[1]報道，在考慮了培養條件和營養物質等因素后，大腸桿菌菌體密度理論上限值能達到200 g·L-1。高密度培養涉及到培養基組成、培養條件等諸多方面。

作者在此就大腸桿菌高密度培養的影響因素、培養方法及基因工程技術在大腸桿菌高密度培養中的最新應用進行簡要綜述。

1 大腸桿菌高密度培養的影響因素

1.1 菌種

不同的E.coli菌株由于自身代謝系統的不同，在培養條件、對外界環境耐受能力等方面都存在著較大的差異。例如E.coliK系列菌株和E.coliB系列菌株均為較常用的培養菌株，但E.coliB菌株在高密度培養過程中產生的乙酸要比E.coliK少。van de Walle等[2]對E.coliBL21(DE3)和E.coliK(JM109)進行了乙酸代謝研究，發現前者的乙酸積累僅為后者的1/4，菌體密度也高出25%。

1.2 接種量

接種量會影響菌體在發酵罐中的生長速度。較大的接種量可以縮短菌體生長達到最高值的時間，這是因為種子液中含有大量胞外水解酶類，有利于菌體對基質的快速充分利用，縮短生長延遲期。胡爽等[3]在200 L發酵罐中，將接種量由5%增加至10%，最終菌體密度由44.2 g·L-1提高至53.9 g·L-1。但是接種量過大也會使菌體生長過快，菌體生長持續的時間縮短，自溶也較快，反而影響后期的生長。因此，接種時應根據菌體具體的生長情況確定接種量。

1.3 培養基

1.3.1 碳源

不同微生物對碳源的需求各不相同，碳源的種類和濃度對菌體的生長代謝也有不同的影響。葡萄糖是E.coli最易利用的碳源，也是E.coli發酵中最常用的碳源。但葡萄糖濃度超過50 g·L-1后就會抑制E.coli的生長，因此，保持基質中適當的較低的碳源濃度是E.coli高密度培養的關鍵。李民等[5]研究發現，培養基中初糖濃度為10 g·L-1時，菌體密度和產物表達量均獲得了較好的效果。但以葡萄糖作為碳源易產生代謝抑制物質——乙酸，而有研究表明以甘油代替葡萄糖作為E.coli生長的碳源可以減少乙酸的積累，更易達到高密度[6]。Medaglia等[7]在發酵過程中補加麥芽糖和甘油，菌體密度和產物量都提高了2.5倍。

1.3.2 氮源

大量研究表明應對發酵過程中的氮源加以控制，氮源濃度過高對菌體的生長和產物的表達合成都可能產生負面影響。培養E.coli時常用氨水作為主要的氮源，在培養過程中以流加的方式加入培養液，既可用來充當氮源又可用來調節發酵液的pH值，但氨水加入過多會導致細胞的產率下降[8]。碳氮比也是影響E.coli生長的重要因素：當碳氮比過高時，菌體生長代謝緩慢，菌體利用營養物質主要用于合成積累代謝產物；當碳氮比較低時，菌體利用營養物質主要用于自身的生長，菌體初期生長繁殖旺盛，導致代謝廢物增多，發酵液粘度增大，進而影響溶氧，使菌體后期生長受到抑制并造成菌體提前衰老自溶。

1.3.3 微量元素

E.coli對鈣、鈷、鐵、鋁、錳、錫等微量元素的需求量雖然很小，但微量元素對微生物的生長及活性所起的作用不可忽視，尤其是在高密度培養時更應在培養基中添加適量的微量元素。朱才慶等[9]在培養E.coliDA19時發現，在基本培養基中添加混合微量元素能大大改善菌體生長。

1.4 培養條件

1.4.1 溫度

溫度對E.coli的生長繁殖有很大的影響。在一定范圍內，隨著溫度的升高，E.coli比生長速率變大；但溫度進一步升高，E.coli比生長速率反而會減小。E.coli的最適生長溫度為37 ℃，但在近期的一些研究中，經常以低于37 ℃的溫度來培養E.coli，當培養溫度從37 ℃下降至30 ℃左右時，可使細胞的營養物攝入率和比生長速率減小，減少有害抑制產物(主要是乙酸)的積累和代謝熱的產生[10]。Ohta等[11]在培養重組E.coliKS467時，通過將溫度從37 ℃降低到30 ℃，成功地將發酵液中乙酸的濃度從10 g·L-1降至5 g·L-1。程立坤等[12]在32 ℃下培養E.coli時，通過控制比生長速率在0.3 h-1以下，使乙酸濃度降至0.90 g·L-1，菌體密度達到53.42 g·L-1。

1.4.2 溶氧

氧是一種難溶氣體，常溫常壓下氧在純水中的溶解度僅為7 mg·L-1。因此溶氧很容易成為E.coli高密度培養的限制因素，尤其是在高密度培養的后期，發酵液中菌體密度很大，耗氧量極大。溶氧濃度較高時，比生長速率就會增大，使菌體大量繁殖生長；當溶氧濃度超過一定限度時，菌體的比生長速率反而減小，而且還會導致乙酸積累增多，葡萄糖的單位得率反而下降[13]。在高密度培養時，可以通過提高發酵通氣量、攪拌速度、通入純氧等方法來控制溶氧；還可以通過使用氧溶解度高的載體來提高溶氧，如動物來源的血紅蛋白和長鏈的烴等化合物。另外，將能夠提高氧傳遞能力的透明顫藻血紅蛋白(VHB)基因克隆并在菌體中表達，也能取得不錯的效果[14]。

1.4.3 pH值

1.5 有害副產物

E.coli利用葡萄糖產生的主要有害物質是乙酸，尤其是在較大的比生長速率或供養不足時；但當E.coli在葡萄糖過量的條件下生長時，即使氧充足也會產生乙酸[16]。乙酸的積累對E.coli生長繁殖會產生抑制作用，當其濃度大于5 g·L-1時，菌體生長緩慢，菌體得率和最大可達細胞密度均下降；當其濃度超過14 g·L-1時，菌體停止生長[10]。

Han等[17]認為，細菌在比生長速率較小時通過氧化代謝過程產生的能量足以滿足其生長生理的需求，便不會產生乙酸；而在比生長速率較大時，大腸桿菌通過氧化代謝不能產生足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑提供ATP和NADH2。因此，為減少乙酸的積累，可以通過調節限制性底物(如葡萄糖)的供應來控制比生長速率低于臨界值。研究表明，比生長速率超過0.35 h-1時就會產生乙酸[10]，故一般控制比生長速率在0.1～0.35 h-1之間比較合適，但應根據不同的情況選擇合適的比生長速率才能達到高密度培養。另外，通過提高乙酸利用率也能有效減少培養液中乙酸的積累。Oh等[18]認為，乙酸的分解代謝是在許多酶的作用下完成的，而在通常情況下，葡萄糖對這些酶具有抑制作用，所以在含有葡萄糖的培養基中這些酶是以失活狀態存在的。因此，解除這種抑制作用的突變株在利用消耗葡萄糖的同時會不斷地分解消耗培養基中存在的乙酸[19]。

另外，通過優化培養基、降溫培養、透析培養等方法都可以有效地降低乙酸的積累。

2 大腸桿菌高密度培養的方法

E.coli高密度培養的方法主要是補料分批培養。作為目前應用最廣泛、最成熟的培養技術，補料分批培養是一種介于分批培養和連續培養之間的補料方法，是在分批培養過程中間歇或連續地補加新鮮培養基，以達到延長菌體生長期和控制培養過程的目的。補料方法分為非反饋補料和反饋補料。

2.1 非反饋補料

非反饋補料主要包括恒速補料、變速補料、指數補料等。

恒速補料是以恒定的速率流加限制性基質的碳源。隨著發酵的進行，相對于培養液中的菌體來說，營養濃度是逐漸降低的，菌體的比生長速率也慢慢減小，但菌體能夠得到持續的生長，培養液中菌體量在培養過程中是線性增加的。

變速補料是指在培養過程中，營養物質的補加速率以階段性或線性等方式不斷加快或減慢。當菌體濃度較高或菌體生長旺盛時，就加快補料速度，加入更多營養物促進細胞的生長繁殖從而實現高密度；反之，就減慢補料速度。李民等[5]采用三階段式流加葡萄糖的方法培養重組菌生產骨形成蛋白，取得了較好的效果。Son等[20]采用線性提速補料的方法培養重組大腸桿菌生產SOD，細胞得率為17.6 g·L-1。

指數補料是一種簡單而又有效的補料方式，它能使培養體系中營養物的濃度控制在較低的水平，可以有效地減少乙酸等有害代謝物的積累，使菌體密度以一定的比生長速率呈指數形式增加(比生長速率通常維持在0.1～0.35 h-1之間)。Korz等[6]采用指數補料方式，以葡萄糖和甘油為碳源培養重組E.coli，菌體密度分別達到了128 g·L-1及148 g·L-1。孫艷等[21]采用分階段控制比生長速率的指數補料策略培養E.coliJM109，有效緩解了單一比生長速率情況下溶氧不能無限制地增加的問題，控制培養液中乙酸濃度在2.53 g·L-1左右，細胞密度(OD600)達到91.2。

2.2 反饋補料

反饋補料分為恒溶氧法、恒pH值法、CER(CO2排放率)法等。

表1就幾種常用的反饋和非反饋補料方法進行了比較。

由表1可以看出，反饋補料能夠根據反饋的信息及時調整補料的速率和策略，但具有一定的滯后性，不能完全避免糖濃度的波動和代謝副產物的積累；而非反饋補料也存在不能根據發酵環境的變化和菌體生長的具體情況作出反饋調節的缺點。因此，如何結合各補料方法的優點同時摒棄其缺點，找到一種新的、更有效的補料方法成為近期研究的熱點和突破點。Restaino等[24]在培養E.coliK4產莢膜多糖時，采用在發酵前期用指數補料、在發酵后期用微孔過濾的分階段混合補料方法，取得了較好的效果，菌體濃度達到36.4 g·L-1，多糖產量達到4.33 g·L-1。Biener等[25]在培養重組E.coliTB1時，建立了一套以菌體生長過程中產生的熱量為依據進行關聯補料，從而更加準確和持續地控制菌體的比生長速率的培養調控模型，為大腸桿菌的高密度培養提供了新的方向。

表1 高密度培養流加補料方法的比較

2.3 人工神經網絡在補料調控中的應用

由于發酵過程涉及生命體的生長和繁殖，機理復雜，具有高度的非線性、時變性和不確定性，同時過程參數的測量時間長、精度差，因而很難建立適當的計算模型來描述發酵過程[26]。人工神經網絡技術由于具有很強的非線性映射能力，它通過網絡內部權值的調整來擬合系統的輸入輸出關系，即只根據輸入輸出數據來建立模型，可以反映十分復雜的非線性關系，因而很適合于多因變量、多自變量統計中的建模，可以相當準確地模擬系統行為[27]，所以，近年來人工神經網絡技術在發酵過程的控制、優化等方面得到了廣泛的應用。

Duan等[28]在培養E.coliK12時，根據DO-STAT法和pH-STAT法獲得的基礎數據進行神經網絡的建模和訓練，用于溶氧和pH值變化模式的識別，進而辨識葡萄糖是過量還是不足，以便更加準確地控制補料速率，使發酵罐中的葡萄糖控制在適合的水平，既不積累代謝副產物又能使菌體以最大的比生長速率生長，提高了菌體密度和外源蛋白的表達量，取得了較好的效果，菌體濃度達到53 g·L-1。

3 基因工程技術在大腸桿菌高密度培養中的應用

基因工程技術在E.coli高密度培養中的應用主要體現在以下兩方面：

(1)阻斷乙酸產生的主要途徑：通過切斷碳源生成乙酸的主要代謝通路，可以顯著減少乙酸產生。E.coli產生乙酸的途徑有兩條：一是在丙酮酸氧化酶的作用下，直接由丙酮酸產生乙酸，但在E.coli中此酶的活性很低，產生的乙酸很少；另一條是在乙酸激酶(Ack)和磷酸轉乙酰基酶(Pta)的作用下，將乙酰輔酶A轉化為乙酸，這是E.coli產生乙酸的主要途徑。因此通過敲除Pta或Ack基因，使E.coli中合成乙酸的主要途徑受阻，就能有效地減少培養液中乙酸的積累[29]。

(2)改變代謝路徑以減少乙酸的形成：由于代謝溢流的存在，在高密度培養過程中當葡萄糖濃度過高時，菌體攝取的葡萄糖有部分會通過三羧酸循環產生乙酸。因此，研究人員通過改變菌體的葡萄糖代謝途徑，使菌體攝取的碳源更多地流向其自身的結構和功能物質的合成、減少流向乙酸合成的途徑，從而減少乙酸的產生。Soto等[30]通過構建代謝工程菌，使葡萄糖在半乳糖透性酶和葡萄糖激酶的作用下代謝分解，取代原有的磷酸烯醇式丙酮酸的代謝途徑，用100 g·L-1的初始葡萄糖濃度培養野生型E.coliW3110和代謝工程菌E.coliVH33，結果顯示：E.coliW3110產生的乙酸濃度達到5.3 g·L-1，而E.coliVH33產生的乙酸濃度只有2 g·L-1。Knabben等[31]用初始濃度為130 g·L-1的葡萄糖培養代謝工程菌，使培養液中乙酸的濃度降至0.5 g·L-1左右。

4 結語

目前，人們對大腸桿菌高密度培養進行了大量的研究，并取得了許多成就：了解了許多影響其高密度培養的因素；研究了多種不同的補料方式。同時，隨著培養控制手段的進一步發展，監控的培養參數越來越詳細，對細菌代謝過程的了解和掌握也越來越透徹，更有利于研究和控制其培養過程。但仍然還有許多不足和不夠完善的地方，對大腸桿菌的生長代謝理論也還有待更深入詳細地研究。

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