AE3通過NO通路參與心肌細胞缺氧預適應的保護作用

廖章萍，劉 丹，王淑霞，李文娟，陳和平，何 明

(1.南昌大學藥學院藥理學與分子治療學教研室，江西南昌 330006;2.江西省人民醫院，江西南昌 330046)

各種原因造成的心肌組織血液灌注量減少可使細胞發生缺血性損傷，恢復血液再灌注后，缺血性損傷不但沒有緩解，反而進一步加重，這種現象稱為心肌缺血/再灌注損傷。1986年 Murry等［1］發現，如預先反復短暫的缺血/再灌注則可延緩或減輕隨后較長時間缺血所致的心肌損傷，并把此現象稱之心肌缺血預適應。

心肌缺血/再灌注損傷會引起心肌細胞內pH值的變化，pH可調節多種細胞事件，包括離子通道傳導、鈣離子內環境穩態等，在心肌中，鈣離子穩態及鈣對肌絲的敏感性都受pH變化影響，pH也調節縫隙連接及心肌細胞電生理偶聯。陰離子交換蛋白(anion exchanger，AEs)在調節細胞內酸堿平衡，維持細胞內pH值的穩定起著非常重要的作用。AEs是一種多功能嵌膜蛋白，具有Cl－/HCO3－交換功能，泵出 HCO3－，同時泵入 Cl－，使細胞內酸化［2］。

激活此離子交換系統，一方面，使細胞內Cl－濃度增加，另一方面，可使細胞內pH發生改變［3］。AEs包括AE1、AE2、AE3和AE4四個亞型，其中AE3在心肌中表達豐度最高。目前，關于AEs蛋白在心肌急性損傷病理生理過程的變化及其功能的研究很少，而有關AEs是否是通過細胞內某些信號轉導途徑發揮作用更是缺乏深入探討。NO通路是近年來心肌細胞信號傳導通路的研究熱點，大量研究都已證實NO［4－6］參與了心肌細胞缺血缺氧預適應保護作用。故本實驗采用Spraguer-Dawley(SD)乳鼠原代培養的心肌細胞，建立缺氧/復氧(A/R)和缺氧預適應(APC)模型，觀察AE3蛋白在心肌細胞缺氧預適應保護中的意義及與NO信號轉導通路的關系。

1 材料與方法

1.1 動物 SD新生大鼠(1～3 d)，♀♂不拘，由南昌大學醫學院醫學實驗動物科學部提供。

1.2 藥品與主要試劑 MEM培養基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，LNAME(L-N-Nitro-Arginine Methyl Ester):Sigma公司;MTT:Ameresco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸酶(CPK)試劑盒:Beckman公司;引物合成:上海生工生物工程技術服務有限公司;AE3抗體、β-actin抗體及相應二抗均購自Santa Cruz;總蛋白提取試劑盒:普利來公司。其余化學試劑均為國產分析純。

1.3 心肌細胞的分離培養 參照陳杰等［7］方法。取出生1～3 d的SD大鼠，消毒后開胸取出心臟，分離心室組織，用0.1%胰酶消化分離心肌細胞，再加入含15%胎牛血清的MEM培養基混懸后置CO2培養箱(5%CO2，37℃)培養2 h，利用差速貼壁法去除成纖維細胞，將懸浮的心肌細胞用200目不銹鋼網過濾，接種于相應的培養板內，于5%CO2，飽和濕度及37℃條件下培養，隔天更換培養液。

1.4 心肌細胞缺氧/復氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型建立 心肌細胞生長接近融合狀態時，對培養心肌細胞換用預先經95%N2和5%CO2混和氣體飽和過的模擬缺氧缺糖溶液(mmol·L－1，NaH2PO40.9，NaHCO36.0，CaCl21.8，MgSO41.2，HEPES 20，NaCl 98.5，KCl 10.0，pH 6.8，37℃)，置于持續95%N2－5%CO2平衡的A/R裝置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再換用模擬再灌注溶液(mmol·L－1，NaCl 129.5，KCl 5.0，NaH2PO40.9，NaHCO320，CaCl21.8，MgSO41.2，glucose 55，HEPES 20，pH 7.4)，37℃于95%O2－5%CO2復氧孵育2 h。

1.5 心肌細胞缺氧預適應(anoxia preconditioning，APC)模型建立 心肌細胞換預先經95%N2和5%CO2混和氣體飽和過的模擬缺氧液，將細胞置于95%N2－5%CO2持續通氣的缺氧密閉容器中(37℃)30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進行復氧孵育30 min(37℃)，重復3次。

1.6 實驗分組 心肌細胞培養4 d后隨機分組進行實驗。實驗共分4組，每組重復8次。① Control組:棄培養液，換用正常 Tyrode溶液置于培養箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育3 h后，再換上模擬再灌注溶液置于培養箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育2 h;②A/R組:棄培養液，換用模擬缺氧缺糖溶液將培養板置于持續95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h，再換上模擬再灌注液，以95%O2、5%CO2混合氣體進行復氧孵育 2 h(37℃);③ APC組:棄培養液，換用模擬缺氧缺糖液置于培養箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進行復氧孵育30 min(37℃)，重復3次;然后進行A/R處理;④ L-NAME組:在APC處理前用終濃度為50 μmol·L－1NO合成酶抑制劑L-NAME與細胞孵育30 min后，余同APC組。

1.7 心肌細胞AE3 mRNA的檢測 用TRIzol裂解心肌細胞提取RNA，經逆轉錄成cDNA，加入AE3和β-actin特異引物進行PCR擴增。AE3上、下游引物分別為:5'-AGGTCATGGAGCCCAATGG-3'，5'-GAACTTGATCCAGCGTG-3'。β-actin上下游引物分別為:5'-AAGGATTCCTATGTGGGC-3'，5'-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3'。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過Image Tool圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的AE3的mRNA表達量。

1.8 心肌細胞AE3蛋白的檢測 按蛋白提取試劑盒的方法提取心肌細胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，－20℃保存。取上述細胞蛋白提取液上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，15%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，經封閉、洗脫后加入AE3抗體(1∶500)或βactin抗體(1∶200)，放置4℃過夜，洗膜后以相應的二抗孵育1 h，再洗膜，加ECL化學發光試劑，置暗室中曝光、顯影、定影膠片。將X線膠片掃描后，在Image Tool醫學圖形分析軟件上進行分析。將所得AE3蛋白帶的綜合密度分別除以β-actin相對應樣本的綜合密度。

1.9 細胞存活率檢測 采取MTT比色法檢測。培養于96孔培養板的H9c2心肌細胞，接種密度為104cells·well－1。實驗處理后每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μl，孵育 4 h;每孔加入 150 μl DMSO振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值。設不加細胞，只加孵育液的空白對照，記錄結果。細胞存活率/%=(實驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

1.10 生化檢測 實驗結束后各組分別取孵育液200 μl，美國Beckman生化自動分析儀測定LDH和CPK活性。

2 結果

2.1 不同處理組對AE3 mRNA表達的影響 以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的心肌細胞AE3的 mRNA表達量，Control組、A/R組、APC組、L-NAME 組分別為 0.27±0.08、0.40±0.06、1.44±0.10、0.45±0.08。A/R 組 AE3 mRNA 轉錄較Control組增加(P＜0.05)。APC組心肌細胞AE3 mRNA不僅均較Control組轉錄明顯上調，而且較A/R組也明顯上調(P＜0.01)。但預先加入NO合成酶抑制劑L-NAME則抑制了APC處理時AE3 mRNA轉錄的增強(P＜0.01)(Fig 1)。

2.2 不同處理組對AE3蛋白表達的影響 以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組的心肌細胞AE3的蛋白表達量，Control組、A/R組、APC組、LNAME組分別為 0.23±0.06、0.36±0.08、1.16±0.10、0.39±0.06。A/R組AE3蛋白表達較Control組增加。APC組心肌細胞AE3蛋白與A/R組比較也明顯上調(P＜0.01)。而L-NAME則抑制了APC組AE3蛋白的上調(P＜0.01)。這一結果與上述心肌細胞AE3 mRNA的變化基本吻合(Fig 2)。

Fig 1 Effect of various treatments on expression of AE3 mRNA of cultured cardiomyocytes

Fig 2 Effect of various treatments on expression of AE3 protein of cultured cardiomyocytes

2.3 不同處理組對心肌細胞A/R損傷后LDH、CPK活性的影響 如Fig 3所示，與Control組比，A/R組細胞懸液中LDH及CPK活性分別增加至4.5、4倍(P＜0.01)。經APC處理則能降低 LDH及CPK活性(P＜0.01);但加入L-NAME則可取消APC的保護作用，LDH及CPK活性與A/R組無差異。

2.4 不同處理組對心肌細胞A/R損傷后細胞存活率的影響 MTT結果(Fig 4)顯示，經A/R處理后，H9c2心肌細胞嚴重受損，細胞存活率較Control組降低47%;APC則能防止細胞損傷，細胞存活率上升至88%，較A/R組增高;而L-NAME可取消APC的心肌保護作用。

Fig 3 Effect of various treatments on LDH and CPK activity in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

Fig 4 Effect of various treatments on cell viability in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

3 討論

大量研究發現心肌缺血/再灌注損傷、缺血預適應保護作用與心肌細胞內的Na+、K+、Ca2+等陽離子穩態的變化密切相關，然而，對于陰離子轉運的有關研究卻很少。心肌細胞內的陰離子包括 Cl－、SO4

2－、HPO4

2－、有機酸根離子等，其中 Cl－為主要通透性的陰離子，參與了細胞多種活動和功能調節過程，如細胞電活動調節、容積調節、細胞內pH值調節等，且在細胞免疫應答、細胞遷移、細胞增殖和分化及細胞凋亡中發揮一定的作用［8］。

本實驗室前期研究發現Cl－在心肌細胞缺氧/復氧損傷中發揮重要作用，使用氯離子通道阻斷劑SITS可對抗心肌細胞缺氧/復氧損傷，有明顯的保護作用［7］。心肌缺血/再灌注時Cl－濃度的變化與細胞內pH值變化密切相關。AEs蛋白既是心肌細胞pH調節的主要方式之一，也是細胞內的Cl－濃度調節的重要通道蛋白之一。AEs具有雙向轉運Cl－/HCO－的功能，正常情況下其將細胞內HCO－33排出，同時將胞外Cl－移入胞內，使細胞酸化［9］;反之，也可反向轉運Cl－和HCO3－［10］。心臟 AEs的膜性分布允許心肌細胞精確調節細胞內pH，防止代謝性CO2水化產生的HCO3－局部聚集，這對于心肌細胞維持正常的興奮－收縮偶聯及心臟舒縮功能具有非常重要的意義。新近研究亦證明，在肥厚性心肌病模型上，AE3蛋白的缺失可迅速導致失代償及心力衰竭［11］。

本實驗發現經缺氧預處理后，AE3 mRNA轉錄和蛋白表達均明顯上調，提示AE3可能參與了預適應保護，是一種內源性保護蛋白。我們認為，當心肌細胞經過短暫的缺氧處理后，導致心肌細胞內ATP不足、ADP積聚、pH值降低，可能通過某種途徑激活AE3蛋白，AE3蛋白發揮其雙向轉運功能，反向轉運Cl－和HCO3－，減輕心肌細胞內的酸中毒，使心肌細胞的酸堿緩沖容量擴大，調節細胞內pH值在相對恒定的范圍，以維持心肌收縮力。

本實驗中，在心肌缺氧預處理前給予NO合成酶抑制劑L-NAME可抑制AE3 mRNA和蛋白表達的上調，并且取消了缺氧預處理的保護作用，說明預適應引起的AE3表達增加與NO通路有關。大量研究表明，NO在缺血預適應中發揮著重要的作用。短暫多次的缺血/再灌注可通過提高NO合成酶活性，從而促使NO合成增加，激活PKC，導致內源性保護基因轉錄的增加以及蛋白表達的上調，從而發揮調節微血管舒張、減輕氧化應激，減少心律失常發生的心肌保護作用［6］。給予NO受體激動藥同樣也能產生類似缺血預適應的保護作用［12］，而抑制NO的合成釋放則可取消預適應保護［13］。

因此，結合本實驗結果，我們推測AE3可能就是預適應保護物質的一種。缺氧預處理通過激活NO通路，使得AE3表達增加，AE3蛋白發揮其雙向轉運功能，反向轉運Cl－和HCO3－，減輕心肌細胞的酸中毒，發揮心肌保護作用。

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