芹菜素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞化療敏感性的增強作用

李明勇，黃培春

(廣東醫學院病理生理學教研室，廣東湛江 524023)

芹菜素(apigenin，AP)是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，具有多方面的藥理作用，如抗炎［1］、抗氧化［2］和抗腫瘤等作用。其中，以抗腫瘤作用最為突出。實驗證明芹菜素有抑制肺癌A549細胞［3］、多發性骨髓瘤細胞［4］、結腸癌 HT-29 細胞［5］和前列腺癌 PC-3 細胞［6］等的增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤細胞轉移和侵襲以及放化療增敏的作用，且具有低毒、無誘變性等特點［7－8］。本實驗擬觀察AP、順鉑(DDP)單用和合用對體外培養的人鼻咽癌CNE-2Z細胞生長的抑制作用，并用中效原理分析兩種藥物的協同效應，初步探討其促進凋亡及抑制增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人鼻咽癌CNE-2Z細胞由廣東醫學院病生教研室提供。在5%CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清、青霉素1×105U·L－1，鏈霉素100 mg·L－1的RMPI1640培養液傳代培養，實驗用細胞均處于對數生長期。

1.2 主要試劑與藥物 RPMI 1640培養基為Gibco公司產品;小牛血清為四季青公司產品;MTT和DMSO均為AMRESCO公司產品;PI/Hoechst33258為Sigma公司產品;TaKaRa逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司);其余試劑均為分析純。芹菜素(AP)為Sigma公司產品，實驗前用DMSO溶解，培養液稀釋，DMSO終濃度為 0.1%(實驗證明該濃度對細胞無影響 );DDP為南京制藥廠有限公司產品(批號:20110102)。

1.3 方法

1.3.1 采用MTT法分別檢測AP和DDP兩藥單用和合用的效應 將生長良好的CNE-2Z細胞以1×104個/孔180 μl接種于96孔培養板培養24 h。實驗設空白對照組、AP單用組、DDP單用組和AP與DDP合用組，每種情況設3個平行孔，重復3次，取其平均值。將兩種單藥的5個不同濃度分別加在96 孔板內，每孔加藥量 20 μl，AP 終濃度為 10、20、40、80、160 μmol·L－1，DDP 終濃度為 5、10、20、40、80 μmol·L－1;兩藥合用比例為1 ∶1，每孔加藥總量仍為20 μl(每種單藥劑量濃縮至1/2，各加10 μl);空白對照組以RPMI 1640培養液補足，每孔總體系200 μl。培養48 h 后每孔加入20 μl MTT，繼續培養4 h后棄上清，每孔加DMSO 200 μl置搖床低速混勻15 min，自動酶標讀數儀比色波長570 nm測出吸光度值(A值)，并計算藥物對CNE-2Z細胞的增殖抑制率(fa)，計算公式為細胞增殖抑制率(fa)/%=(1－實驗組A值均數/對照組A值均數)×100%。

結果判定方法:參考文獻［9］，兩藥單用及合用的中效濃度(IC50)通過Chou-Talalay聯合指數法計算，中效方程式為:fa/fu=(D/Dm)m求得(式中fa為效應，fu=1－fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為中效曲線斜率)。

兩藥合用在不同效應的聯合指數(CI)的計算公式為:CI=(D1/Dx1)+(D2/Dx2)+α(D1D2/Dx1Dx2)。Dx1、Dx2為兩藥單用時產生x效應的各自所需濃度，兩藥合用時產生x效應所需濃度為Dx(1，2)，均可由中效方程式:fa/fu=(D/Dm)m求得。D1、D2為合用時產生x效應時兩藥各自所需濃度，可由公式D1+D2=Dx(1，2)求出。兩種作用機制不同的藥物聯用時α=0，作用機制相同的藥物聯用時α=1。若CI＜1，認為兩藥協同，CI=1為相加，CI＞1為拮抗。由于芹菜素和順鉑是兩種作用機制不同的藥物，故α=0。

1.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞以4×105個/孔接種于6孔板內培養24 h。實驗分空白對照組、AP(中效濃度)單用組、DDP(中效濃度)單用組和AP與DDP聯合用藥組(為各單用組藥物劑量的1/2)。培養48 h后收集細胞，離心后用70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測前用PBS洗去固定液，再加入0.6 ml PI染液，置4℃冰箱中染色30 min。尼龍網過濾后用流式細胞儀測定各組細胞的細胞凋亡率，每組均重復3次。

1.3.3 熒光雙染法檢測細胞凋亡情況 取對數生長期細胞以4×105個/孔加至放有蓋玻片的6孔板內培養24 h。實驗分組同“1.3.2”項，對照組及各藥物組細胞培養48 h后取出蓋玻片，用冷PBS洗2次，將混勻的PI/Hoechst33258熒光染料混合液滴加于長有細胞的蓋玻片表面并使它均勻覆蓋，避光、室溫反應5 min，將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態及顏色改變以區分出活的、凋亡及壞死細胞并照相。在熒光顯微鏡下，活細胞呈彌漫均勻的藍色熒光，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見多個濃染致密的顆粒塊狀強藍色熒光，如細胞核為均勻的紅色熒光時為壞死細胞。

1.3.4 RT-PCR 檢測 bax、bcl-2 mRNA 的表達 按以上實驗分組處理細胞48 h后，參照文獻［10］略改動，按TRIzol試劑盒說明一步法提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA純度和濃度。逆轉錄反應合成第一鏈cDNA，進行PCR反應。bax上游引物5'-GGG TCT GTT TGC TTT AGG-3'，下游引物5'-GGC TGC TCC AAG GTCA-3'，擴增片斷329 bp;bcl-2上游引物5'-TGG CGT CCC AGG TAG AT-3'，下游引物5'-CGC AGA GGC TGT CAC TT-3'，擴增片斷 235 bp;GAPDH上游引物5'-GGT GAA GGT CGG TGT CAA CG-3'，下游引物 5'-GAG CCC TTC CAC GAT GCC AA-3'。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓100 V，電泳約50 min，紫外透射儀觀察結果并拍照。

2 結果

2.1 兩藥單用及合用時不同濃度的增殖抑制效應AP、DDP單用及合用時隨著藥物濃度增加其增殖抑制效應也增加，并呈劑量依賴性(Fig 1)，兩藥合用時對CNE-2Z細胞的增殖抑制效應明顯強于各單用給藥組，組間比較差異有統計學意義 (P＜0.01)。按中效方程式計算出兩藥單用時AP的IC50為 48.21 μmol·L－1，DDP 的 IC50為 16.34 μmol·L－1，合用時 IC50為21.58 μmol·L－1(其中兩藥各自需要的濃度 AP 為14.39 μmol·L－1，DDP 為7.19 μmol·L－1)。

Fig 1 Inhibitory effects of AP，DDP and AP combined DDP with different concentrations on CNE-2Z cells

2.2 AP、DDP合用時相互作用分析 利用中效原理判定兩藥合用的效果。Fig 2結果顯示，當fa＞20%時(即所需兩藥物濃度逐漸增大時)兩藥合用指數CI＜1，為協同效應。在20% ＜fa＜50%范圍時，隨著兩藥物濃度的增大其協同作用加大，當fa＞50%時，隨著兩藥物濃度的增大其協同作用逐漸減弱。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 AP、DDP單用及合用作用CNE-2Z細胞48 h后，單用藥組及合用藥組均可誘導CNE-2Z細胞凋亡，其中合用組誘導的細胞凋亡率明顯高于單獨用藥和對照組，組間比較差別有顯著性(P＜0.05)，見Fig 3。

2.4 熒光雙染法觀察細胞形態學改變 AP、DDP單用及合用作用 CNE-2Z細胞 48 h，經 Hoechst33258/PI雙重染色后，熒光顯微鏡下發現聯合用藥組染成強藍色，核呈固縮狀或圓珠狀的凋亡細胞和染成紅色的壞死細胞(Fig 4 D)的現象較AP或DDP單用組(Fig 4 B，C)明顯增多;而空白對照組以活細胞(細胞核染色質呈均勻分布的藍色，Fig 4 A)為主，未見凋亡細胞。

Fig 2 The relationship of the fa with the combination index when AP combined with DDP

Fig 3 Apoptotic rate of CNE-2Z cells by different treatment after 48 h

2.5 對CNE-2Z細胞bax、bcl-2 mRNA表達的影響 如Fig 5所示，AP、DDP單用及合用作用CNE-2Z細胞48 h后，均可上調bax和下調bcl-2 mRNA表達，但聯合用藥組上調bax和下調bcl-2 mRNA表達更加明顯，通過軟件對它們光密度積分值分析，組間比較差別有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

近年來，隨著診療技術的進步，早期局部腫瘤的治愈率大大提高。但是對于侵襲、轉移性的晚期腫瘤，化療仍然是主要的治療手段。雖然化療能延長晚期腫瘤患者的生存期和提高他們的生活質量，但化療過程中化療藥物對機體的損害，以及腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，最終導致腫瘤的復發和治療的失敗。因此，尋找既具有抗腫瘤作用又能增強腫瘤細胞對化療藥物敏感性且無明顯毒副作用的天然藥物，是目前腫瘤防治研究的必然趨勢。

Fig 4 Apoptosis detected by Hoechst33258/PI fluorescent staining(×200)

Fig 5 Expression of bax and bcl-2 mRNA in CNE-2Z cells by different treatment after 48h

近年來，AP作為一種新型高效低毒的抗腫瘤藥物已成為腫瘤研究領域的熱點之一。但有關AP抗鼻咽癌作用的實驗研究尚未見報道。因此，利用AP抗鼻咽癌的實驗值得深入研究。本實驗MTT等結果提示AP具有抗鼻咽癌CNE-2Z細胞增殖的作用，且呈明顯的劑量依賴關系，其主要的作用機制可能與直接抑制細胞生長，并誘導細胞凋亡等有關。

聯合用藥是目前化療的主要手段，當多種藥物聯合作用時，如何確定藥物配伍的最佳濃度及作用時間以減少藥物的毒副作用和提高藥物殺腫瘤細胞作用，國內外大多數學者通常引入中效原理和聯合指數來進行評價［10］。本實驗利用中效原理分析AP和DDP兩種藥物之間的相互關系，發現它們聯合應用時各自的IC50濃度均比單用時各自的IC50濃度要小，且在中高濃度范圍時呈協同效應;此外，低濃度的AP與DDP聯合用藥，取得了單藥AP或DDP高濃度時才能得到的療效，提示AP能提高CNE-2Z細胞對DDP的敏感性。

目前研究認為，大多數化療藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡而發揮作用，而腫瘤細胞由于遺傳因素或化療藥物等外源因素的誘導，引起凋亡通路中的抗凋亡蛋白過量表達，促凋亡因子低表達或失活以及存活信號通路活性增強，這些異常改變單獨或共同作用，使得腫瘤細胞凋亡缺陷，對多種化療藥物誘導的凋亡不敏感［11］。因此，通過調整紊亂的凋亡通路是提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性的策略。最近研究發現，AP的放、化療增敏作用可能與其通過調整腫瘤細胞的凋亡通路有關，如Watanabe等［12］研究發現AP可提高X線照射條件下肺癌SQ25細胞內p21/WAFl的表達，降低Bcl-2蛋白表達，從而增加肺癌細胞對放療的敏感性，促進細胞凋亡;Choi等［13］發現AP能下調ErbB2的表達和降低Akt活性，增加乳腺癌MDA-MB-453細胞對5-氟脲嘧啶的敏感性，促使細胞凋亡;胡太平等［14］發現低濃度的AP降低HL-60細胞對化療藥物誘導凋亡的抗性，與下調NF-κB和Bcl-2的表達有關。

bcl-2基因家族在細胞凋亡過程中起著重要作用，其基因家族蛋白之間的比例影響著細胞對各種凋亡刺激分子的敏感性，決定caspases活化與否，從而決定細胞是否發生凋亡［15］，其中Bcl-2/Bax比值決定了接受凋亡刺激后，細胞發生凋亡的易感性。Bcl-2過剩，細胞存活，而當Bax過剩，形成Bax同源二聚體，細胞將易發生凋亡。本實驗結果顯示:低濃度的AP聯合DDP誘導的細胞凋亡率、上調bax和下調bcl-2 mRNA的表達明顯高于單獨用藥和對照組，提示低濃度的AP可通過促凋亡作用和降低細胞對化療藥物誘導凋亡的抗性，增強CNE-2Z細胞對DDP的敏感性。

綜上所述，AP作為一種植物提取的活性成分，結合其不良反應小等特點，渴望其能成為一種理想的化療增敏劑。

［1］ Jeong G S，Lee S H，Jeong S N，et al.Anti-inflammatory effects of apigenin on nicotine-and lipopolysaccharide-stimulated human periodontal ligament cells via heme oxygenase-1［J］.Int Immunopharmacol，2009，9(12):1374 － 80.

［2］ Al Shaal L，Shegokar R，Müller R H.Production and characterization of antioxidant apigenin nanocrystals as a novel UV skin protective formulation［J］.Int J Pharm，2011，420(1):133 －40.

［3］ Lu H F，Chie Y J，Yang M S，et al.Apigenin induces caspase-dependent apoptosis in human lung cancer A549 cells through Baxand Bcl-2-triggered mitochondrial pathway［J］.Int J Oncol，2010，36(6):1477－84.

［4］ Zhao M，Ma J，Zhu H Y，et al.Apigenin inhibits proliferation and induces apoptosis in human multiple myeloma cells through targeting the trinity of CK2，Cdc37 and Hsp90［J］.Mol Cancer，2011，10:104.

［5］ Turktekin M，Konac E，Onen H I，et al.Evaluation of the effects of the flavonoid apigenin on apoptotic pathway gene expression on the colon cancer cell line(HT29)［J］.J Med Food，2011，14(10):1107－17.

［6］ Kaur P，Shukla S，Gupta S.Plant flavonoid apigenin inactivates Akt to trigger apoptosis in human prostate cancer:an in vitro and in vivo study［J］.Carcinogenesis，2008，29(11):2210 －7.

［7］ Clere N，Faure S，Martinez M C，et al.Anticancer properties of flavonoids:roles in various stages of carcinogenesis［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2011，9(2):62 －77.

［8］ Bokulic A，Garaj-Vrhovac V，Brajsa K，et al.The effect of apigenin on cyclophosphamide and doxorubicin genotoxicity in vitro and in vivo［J］.J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng，2011，46(5):526 －33.

［9］ Chou T C，Talalay P.Quantitative analysis of dose-effects relationships:the combined effect of multiple drugs on enzyme inhibitors［J］.Adv Enzyme Regul，1984，22(1):27 －55.

［10］ Hennessey V G，Rosner G L，Bast RC Jr，Chen M Y.A Bayesian approach to dose-response assessment and synergy and its application to in vitro dose-response studies［J］.Biometrics，2010，66(4):1275－83.

［11］劉小東，孫 華，劉耕陶.基于調控細胞凋亡的腫瘤化療增敏策略［J］.中國藥理學通報，2009，25(10):1261 －4.

［11］ Liu X D，Sun H，Liu G T.Tumor chemosensitization strategies based on apoptosis manipulations［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(10):1261－4.

［12］ Watanabe N，Hirayama R，Kubota N.The chemopreventive flavonoid apigenin confers radiosensitizing effect in human tumor cells grown as monolayers and spheroids［J］.J Radiat Res(Tokyo)，2007，48(1):45 －50.

［13］ Choi E J，Kim G H.5-Fluorouracil combined with apigenin enhances anticancer activity through induction of apoptosis in human breast cancer MDA-MB-453 cells［J］.Oncol Rep，2009，22:1533－7.

［14］胡太平，陳偉強，曹建國.芹菜素對人急性髓性白血病細胞化療敏感性的增強作用［J］.鄭州大學學報(醫學版)，2007，42(3):515－7.

［14］ Hu T P，Chen W Q，Cao J G.Chemosensitization effects of apigenin on cisplatin in human acute myeloid leukaemia HL-60 cells［J］.J Zhengzhou Univ(Med Sci)，2007，42(3):515 －7.

［15］ Wong W W，Puthalakath H.Bcl-2 family proteins:the sentinels of the mitochondrial apoptosis pathway［J］.IUBMB Life，2008，60(6):390－7.