Cocktail探針藥物法評價生、醋莪術對CYP450酶亞型的影響

王 菊，陸兔林，2，毛春芹，肖永慶，顧娟娟

(1.國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心、國家中醫藥管理局中藥炮制標準重點研究室、江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京 210046;2.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046;3.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

莪術為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis Val、廣西莪術 Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，莪術臨床應用廣泛，是一種有很大開發潛力和廣闊市場前景的中藥［1－2］。

在肝臟中含量較高的細胞色素P450(CYP450)是最重要的藥物代謝酶，藥物進入體內受CYP450代謝轉化，同時影響CYP450的表達水平，誘導和抑制其同工酶的活性［3－5］。Cocktail探針藥物法能對多種同工酶同時進行測定，省時，經濟且個體間差異小，在藥動學研究和臨床合理用藥方面有重大意義［6－7］。

莪術臨床應用廣泛，且臨床上應用較多的是醋莪術。據大量文獻證明，醋制從增強療效來看，確與中醫基本理論相符，但醋莪術增效的作用機制尚不明確。本實驗以茶堿、氨苯酚、氯唑沙宗為探針底物，考察生、醋莪術對CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影響，以探討莪術醋制前后與醋制增效的相關性，從而為臨床合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)包括:四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器;色譜柱:Kromasil C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Anke TGH016C 離心機(上海安亭科學儀器廠);XW-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);MTN-2800W氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電子天平(Mettler Toledo AG285);

1.2 藥物與試劑 茶堿(批號:100121－199903);氯唑沙宗(批號:100364－200301);安替比林(批號:100506－200301);以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，用于含量測定。氨苯酚(購自Sigma公司，用于含量測定)。乙腈為色譜純;乙酸乙酯為分析純;重蒸水為自制。

1.3 提取液的制備 取凈莪術，參照2010版《中國藥典》制得生、醋莪術飲片，粉碎，過篩(3號)。取生品及醋品適量，分別加15倍量的體積分數為0.90的乙醇加熱回流兩次，提取液減壓濃縮至無醇味，制得生、醋莪術藥液。

1.4 動物及給藥方法 ♂性SD大鼠，18只，體質量(250±20)g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買，合格證號:SCXK(滬)2007一0005。動物隨機分為空白組、生莪術組及醋莪術組。生、醋莪術組分別單次灌胃給予生、醋莪術藥液(9 g·kg－1:約為臨床劑量的10倍)，空白組給予同等劑量的生理鹽水。給藥5 min后灌胃給予茶堿(30 mg·kg－1)、氨苯酚(20 mg·kg－1)和氯唑沙宗(50 mg·kg－1)混合探針藥液。分別于給藥前 0 h 和 0.05、0.15、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12 和24 h 從眼底靜脈叢采血。4 000 r·min－1離心10 min后取血漿于－20℃保存待用。

1.5 大鼠含藥血漿樣品處理 精密吸取大鼠血漿100 μl，加入內標液 20 μl，加入乙酸乙酯 800 μl，渦旋震蕩 2 min，14 000 r·min－1離心 10 min，分取有機相700 μl，氮氣吹干后加30%乙腈100 μl溶解。

1.6 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相以乙腈(A)－ 水(B)，洗脫程序:0～10 mim，A為12% ～40%;10～22 min，A為40%;22～24 min，A 為40% ～12%;24～30 min，A為12%。流速1.0 ml·min－1;檢測波長280 nm;柱溫 35℃;進樣量 10 μl。

1.7 血漿標準曲線的制備 取空白血漿100 μl，加入20 μl系列濃度的混合對照品溶液，使血漿中各化合物的系列濃度分別為茶堿 32.64、26.11、16.32、6.528、3.264、1.306、0.6528 mg·L－1;氨苯酚:32.61、26.09、16.30、6.522、3.261、1.304、0.6522 mg·L－1;氯唑沙宗:16.96、13.57、8.480、3.392、1.696、0.6784、0.3392 mg·L－1。加入 20 μl內標后，其余操作步驟按“1.5大鼠含藥血漿樣品處理”項下確定的方法進行。

1.8 統計學處理 茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥動學參數采用DAS1.0軟件計算，各探針的藥動學參數差異以配對t檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 色譜行為 本實驗條件下，3種探針藥物與內標分離良好，無雜峰干擾測定，基線平穩。本方法具有較高的特異性，能準確測定血漿中的茶堿、氨苯酚、氯唑沙宗的濃度，重現性好。見Fig 1。

2.2 標準曲線 根據血漿標準曲線所測結果，將探針藥物和內標的峰面積比值對探針藥物的量濃度進行線性回歸，得回歸方程，茶堿:Y=0.2154X－0.0358，r=0.9982;氨苯酚:Y=0.2849X －0.3008，r=0.9971;氯唑沙宗:Y=0.3642X－0.0398，r=0.9982。

2.3 精密度與提取回收率 考察日內與日間精密度。按標準曲線制備方法制備高、中、低3個濃度的質控血漿樣品，每個濃度平行5份，隨行同日標準曲線計算求得精密度，結果表明日內和日間精密度均小于15%。同時測得探針藥物的提取回收率分別為:茶堿(83.0±2.5)%、氨苯酚(76.0±6.7)%、氯唑沙宗(90.1±4.5)%。

2.4 穩定性考察 本實驗考察了血漿樣品在室溫下放置24 h、3個凍融循環后的樣品穩定性，發現茶堿、氨苯酚及氯唑沙宗的血漿樣品在室溫下放置24 h及反復凍融3次后測定結果穩定。

Fig 1 Chromatograms of the assay

2.5 藥動學參數

2.5.1 3種探針藥物的藥－時曲線 大鼠灌胃生、醋莪術后，按“1.4”項下方法操作，測得3種探針藥物的血藥濃度，結果見Fig 2。由Fig 2可知，大鼠給予生莪術后，氨苯酚及氯唑沙宗的Cmax有所降低，但與空白組差異無顯著性。茶堿的Cmax雖明顯增大但其他藥動學參數無變化;大鼠給予醋莪術后，茶堿與氨苯酚的Cmax明顯降低。結合其他藥動學參數，實驗結果表明，生莪術對3種亞型酶活性影響并不明顯，醋莪術對CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，對CYP3A4具有誘導作用。

2.5.2 3種探針藥物的藥動學參數 茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥代動力學數據經中國藥理學會推薦的DAS1.0程序處理，3種探針藥的藥動學參數見Tab 1。

Fig 2 Pharmacokinetic profile of probe drugs in plasma

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of three probe drugs(n=6)

單次給以大鼠生、醋莪術后，生莪術的茶堿、氨苯酚和氯唑沙宗的藥動學參數與空白組相比差異沒有顯著性;但醋莪術與空白組相比，茶堿的、Tmax和AUC明顯增加，Cmax、CL/F明顯降低;氨苯酚的變化不明顯，AUC明顯降低，CL/F明顯增加;氯唑沙宗的、Tmax、AUC 明顯增加，CL/F 明顯降低。

3 討論

實驗結果表明，生莪術對3種亞型酶活性影響并不明顯，這可能與單次給藥有關。醋莪術對CYP1A2和CYP2E1具有抑制作用，對CYP3A4具有誘導作用。莪術臨床應用廣泛，但中醫臨床上應用較多的是醋莪術，通過炮制改變藥物代謝酶的活性，因此在臨床上使用醋莪術時，合并使用經CYP1A2、CYP3A4和 CYP2E1代謝的藥物，應充分考慮其給藥劑量對合用藥物代謝的影響，必要時應注意調整合用藥物的給藥劑量，從而為臨床制定合理的給藥方案提供依據，將可能出現的不良代謝性藥物相互作用降到最低程度。

本實驗采用“Cocktail”探針藥物法研究了生、醋莪術對大鼠CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1這3種亞型的酶的作用并進行比較，為聯合給藥時給藥方案的制定提供理論支撐，為探討莪術醋制增效的機制提供一定依據，并很好的指導臨床安全、有效、合理用藥。

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