DIDS對SIN-1誘導大鼠海馬神經元凋亡及PARP-1/AIF表達的影響

李 曦，尹金寶，鐘志超，范洪領，許黎娟，鄭原印，蔡仕寧，常全忠

(1.遵義醫學院珠海校區生理學教研室，廣東珠海 519041;2.廣東醫學院東莞校區病理學教研室，廣東 東莞 523770)

資料顯示，氯通道可能在多種非神經細胞凋亡過程中起重要的作用［1－2］。Takahashi等［3］在轉基因小鼠中利用STS誘導培養心肌細胞凋亡，結果顯示氯通道阻斷劑DIDS和NPPB能夠抑制缺血心肌細胞的凋亡，認為ClC-3氯通道可能參與缺血心肌細胞的凋亡。

目前對氯通道是否參與缺血性腦損傷后海馬神經元的凋亡過程報道甚少。本研究模擬腦缺血性腦損傷一氧化氮(NO)過量產生的機制，利用SIN-1作為NO供體誘導離體大鼠海馬神經元凋亡，試圖通過觀察氯通道的活動是否參與了神經元的凋亡過程，探討缺血缺氧敏感性神經元的凋亡與氯通道之間的關系，為臨床腦缺血神經元損傷產生機制的研究和治療提供新的實驗參考。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 新生1 d SD大鼠由遵義醫學院珠海校區動物實驗中心提供;Neurobasal培養基、B27購自Gibco BRL公司，多聚賴氨酸(poly-D-Lysine，PLL)、阿糖胞苷、DIDS(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'disulfonic acid)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium)SIN-1(3-morpholinosyndnomine)、Poly(ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)、Apoptosis-inducing factor(AIF)和Hoechst 33258等試劑購自美國Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(香港試劑公司);Anti-Caspases-3(Santa Cruz)。

1.2 海馬神經元的培養 參照方法［4］取生1 d內的SD大鼠，♀♂不拘，無菌斷頭取腦，在冰冷DHank's里分離雙側海馬，剪成約1 mm3小塊，用0.25%濃度的胰蛋白酶37℃ 消化15 min，加基礎培養基終止消化，機械吹打分散細胞，400目篩網過濾，制成單細胞懸液，1 000 r·min－1室溫離心10 min，去上清液，加完全培養基，吹打分散細胞后制成4×108個·L－1的單細胞懸液，接種在預先包被有PLL的24孔或96孔培養扳內，置于培養箱內，通以95%空氣、5%CO2，37℃飽和濕度下培養。培養液中含有90%Neurobasal培養基、10%胎牛血清，2×10－3mol·L－1谷氨酰胺、1 ×105IU·L－1青、鏈霉素。接種48 h后更換培養液，同時加入1×10－5mol·L－1阿糖胞苷作用48 h，常規更換培養液。

1.3 實驗分組 取培養12 d的海馬神經元，隨機分為:正常對照組(僅用Neurobasal完全培養基);SIN-1處理組;SIN-1+氯通道阻斷劑DIDS組。參照實驗［5］SIN-1 的作用濃度是 0.5 mmol·L－1，與氯通道阻斷劑的作用時間均為18 h。氯通道阻斷劑與SIN-1同時加入培養基內。

1.4 MTT法細胞存活率的測定 參照方法［5］，取96孔培養板培養12 d的海馬神經元，加入MTT，終濃度為0.5 g·L－1，37℃下繼續培養4 h后吸去培養液，加入DMSO振蕩10 min，以不加細胞的培養液空白孔作對照，酶標儀(Bio-tek，USA)檢測光密度OD。

1.5 Hoechst 33258 DNA熒光染色 參照方法［6－7］，將海馬神經元用 0.01 mol·L－1pH 7.4 的PBS沖洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，加 Hoechst 33258(Sigma，St.Louis，MO，USA)(0.25 m/g·L－1)，靜置 15 min，倒置熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)200倍視野觀察細胞核的形態，攝像，隨機計數3個視野內200個細胞，計算凋亡細胞百分數。

1.6 免疫組織化學熒光對PARP-1和AIF染色參照方法［8－9］對神經元進行PARP-1和AIF的免疫熒光染色:將海馬神經元用0.01 mol·L－1pH 7.4的PBS沖洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，山羊血清封閉，加入一抗抗PARP1(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1∶800)或抗AIF(兔抗鼠，Sigma，St.Louis，MO，USA)(1 ∶800)，4℃過夜，加熒光標記的二抗IgG(羊抗兔，1∶200，武漢，博士德)，30 min后熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)下觀察，攝像。

1.7 Western blot測定 Caspase-3、PARP-1和AIF蛋白 取各組海馬神經元，參照方法［10－11］處理細胞提取細胞蛋白，用冰冷的0.1mol·L－1PBS洗滌2次→加85℃的上樣緩沖液收集細胞→SDS-PAGE電泳→PVDF膜轉移→3%BSA封閉液封閉，4℃過夜→加兔抗鼠多克隆抗體Caspase-3(1∶5 000)或抗鼠PARP-1(1∶5 000)或抗鼠AIF抗體(1∶5 000)，室溫反應2 h→TBS-Trs溶液洗3×10 min→HRP-標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫反應2h→TBS-T洗3次×5min→ECL顯影→壓片曝光。

2 結果

2.1 DIDS拮抗NO作用的濃度效應 0.5 mmol·L－1SIN-1組的細胞生存率為61.28%，氯通道阻斷劑DIDS對NO供體SIN-1誘導海馬神經元損傷具有拮抗作用并有濃度依賴性，0.1 mmol·L－1的DIDS對神經元損傷的保護效應比較明顯，與SIN-1組相比差異有顯著性。結果如Fig 1。

Fig 1 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal injury induced by SIN-1(±s，n=6)

2.2 Hoechst 33258染色結果 正常對照組神經元的核呈藍色熒光，SIN-1(0.5 mmol·L－1)組大量神經元的核呈強亮色熒光并較正常核小，提示核固縮，神經元凋亡;SIN-1(0.1 mmol·L－1)+DIDS(0.1 mmol·L－1)組的強亮色熒光明顯減少。如Fig 2。

Fig 2 Effects of DIDS on the cultured hippocampal neuronal apoptosis induced by SIN-1.

2.3 免疫組織化學熒光染色結果 免疫熒光染色顯示，抗NeuN抗體呈紅色，抗PARP-1/AIF抗體呈綠色，SIN-1組有明顯的PARP-1/AIF熒光增強，SIN-1+DIDS組的熒光較SIN-1組減弱(Fig 3)。

Fig 3 Immunofluorescent results

2.4 Western blot對各組 Caspase-3、PARP-1/AIF蛋白檢測結果 Western blot結果顯示:正常培養的神經元內的Caspase-3很少被激活，蛋白印跡可表現出32 ku肽段條帶，SIN-1處理后的神經元內有大量的Caspase-3活化的片段17KD和11 ku，氯通道阻斷劑DIDS(0.1 mmol·L－1)能不同程度的減少Caspase-3的激活;PARP-1的活化形式89 ku和AIF(67 ku)在SIN-1+DIDS組明顯弱于SIN-1組(Fig 4)。

Fig 4 Results of Western blot.

3 討論

在缺血性腦損傷中，海馬是最容易損傷的部位，而且缺血后的半暗區神經元的主要損傷方式是凋亡，過量產生的NO是神經元凋亡機制之一［12］。本實驗模擬缺血性腦損傷的發生機制，用SIN-1作為NO供體誘導離體大鼠海馬神經元凋亡。SIN-1在水溶液中能釋放出大量NO并形成OONO－自由基產生細胞毒性作用［7］。本研究通過分析細胞生存率和凋亡執行蛋白Caspase-3的變化，與對照組相比差異有顯著性，提示SIN-1(0.5 mmol·L－1)誘導的神經元凋亡模型是成功的。

正常情況下，Caspase-3是32 ku沒有活性的形式存在，凋亡發生時，沒有活性的Caspase-3斷裂為有活性的17 ku和11 ku片段，Caspases-3的激活是細胞遭受各種損傷后Caspase依賴性凋亡信號通路的執行蛋白酶，Caspase-3的抑制可以保護細胞免受凋亡的損傷，檢測該酶的活性狀態可以作為檢測細胞發生凋亡的指標，理論上抑制該酶的活性是抑制凋亡發生的有效措施［9］。本實驗結果顯示，DIDS(0.1 mmol·L－1)明顯抑制了Caspase-3的激活，提示氯通道阻斷劑可通過Caspase依賴性途徑抑制神經元凋亡。目前認為，PARP-1/AIF是神經元非Caspase依賴性凋亡信號通路中的靶點分子，PARP-1在正常情況下參與DNA的修復，過量表達并激活產生的片段可引起神經元的凋亡［13－14］。本研究通過免疫熒光和蛋白電泳檢測顯示，DIDS能明顯削弱PARP-1/AIF的表達并能減少PARP-1的活性形式89 ku的形成，提示DIDS的抗凋亡作用可能與此途徑有關。

本實驗結果提示，氯通道的活動可能參與了NO供體SIN-1誘導神經元凋亡過程，在這一過程中，氯通道的活動通過什么機制抑制了凋亡通路中信號蛋白的表達有待于進一步研究。揭示氯通道在神經元凋亡中的作用，將為凋亡的發生機制從離子通道方面提供新的理論，為臨床腦缺血性腦損傷的治療和靶點藥物的探索提供實驗和理論參考。

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