白藜蘆醇預處理對局灶性腦缺血/再灌注大鼠海馬CA1區神經元凋亡的保護作用和機制

方 芳，李 珍，王烈成，祝 延，2，周 藝，柯道平，朱潔平

(1.安徽醫科大學生理學教研室，安徽 合肥 230032;2.蚌埠醫學院生理學教研室，安徽蚌埠 233000;3.安徽醫科大學附屬六安醫院，安徽 六安 237000;4.皖西衛生職業學院，安徽 六安 237000)

腦缺血性疾病是神經系統常見病癥，其中以缺血/再灌注后導致神經元凋亡所引起的繼發性腦損傷危害最大，常導致嚴重的神經功能障礙［1］。如何降低腦缺血病人的發病率，減少缺血所致神經細胞的凋亡，提高病人的存活率，是目前預防腦缺血性疾病急需解決的問題。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、決明等植物性食物或藥物中的多酚類化合物，近年來的研究表明Res對人體許多重要器官，比如腎臟、腦、心臟的缺血損傷都具有保護作用［2－3］。而缺血預處理可以減少腦缺血性損傷，減少細胞的凋亡及壞死［4］。我們近期的研究證明Res預處理對腦缺血/再灌注具有一定的神經保護作用［5］，但其保護作用機制是否涉及到凋亡及其相應的信號轉導通路，目前尚未見報道。為此，我們利用TUNEL法和免疫組化法對大鼠海馬CA1區神經元凋亡及相應凋亡蛋白進行檢測，以期能夠對Res的神經保護作用機制進行進一步探討，從而為臨床研發預防腦血管疾病的新藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 白藜蘆醇，Sigma公司;兔抗鼠 Caspase-3、PI3K、p-Akt多克隆抗體均購自 Bioworld公司;細胞凋亡原位檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)，Roche 公司;光學顯微鏡及其拍照分析系統，日本Olympus公司。

1.2 動物分組 ♂SD大鼠60只(220～250 g)，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，隨機分為3組:假手術組(Sham)、缺血/再灌注組(I/R)、白藜蘆醇預處理組(Res+I/R)，每組20只。假手術組大鼠只分離血管，不留置拴線;I/R組大鼠采用栓線法阻塞右側大腦中動脈，90 min后拔出拴線給予再灌注;Res+I/R組大鼠在缺血前1 h腹腔注射Res(30 mg·kg－1)。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血模型制備［6］采用頸內動脈栓線法制備大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)腦缺血模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i p)麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，頸部正中切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，輕輕剝離迷走神經，結扎頸外動脈和頸內動脈上的所有分支。頸總動脈切口，插入直徑為0.26 mm的MCAO栓線(購自北京沙東生物技術有限公司)，轉過頸總動脈分叉進入頸內動脈，然后緩緩插入，至有輕微阻力時為止(自分叉處約20 mm)，阻斷大腦中動脈的所有血供。缺血90 min后，輕輕拔出MCAO栓線，恢復血供進行再灌注。在實驗過程中保持動物體溫(37±0.5)℃。

1.3.2 模型篩選標準 再灌注后22 h，按Bederson方法［7］進行肢體功能的神經缺損評分，標準:0分，無任何神經功能損失;1分，提尾左前肢屈曲內收;2分，向左側行走;3分，向左側轉圈，成追尾狀。只有評分在1分以上，且取腦時腦底無凝血塊，動脈環無血栓形成，排除蛛網膜下腔出血和繼發性血栓形成的大鼠才可被選入繼后的實驗組。I/R組和Res組共40只動物，其中2只因麻醉意外死亡，3只線栓推進失敗，實際觀察35只，出現上述神經病學癥狀31只，成功率為88.57%。

1.3.3 TTC染色測定梗死范圍 按照朱東亞報道的方法測定梗死范圍［8］。再灌注后24 h，動物斷頭取腦，去嗅球、小腦和腦干，用生理鹽水沖洗大腦表面血污，吸干，–20℃冷凍5～10 min使之變硬，沿冠狀面切成1.5 mm厚的腦片，置于2%的TTC染液中37℃染色30 min。正常組織呈鮮紅色，梗死組織呈灰白色。將顯色后的腦切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，細心將梗死區挖下，稱重，以梗死組織的重量占缺血側腦重量的百分比作為相對梗死范圍。

1.3.4 原位細胞凋亡檢測(TUNEL法)在缺血/再灌注后第5天，用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i p)麻醉后，經心臟灌注4%多聚甲醛固定至大鼠四肢僵硬，取出缺血側大腦放入相應固定液中于4℃冰箱中固定過夜。截取視交叉至大腦橫裂的部分，常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚 4 μm。按TUNEL檢測試劑盒進行操作，DAB顯色，蘇木精復染。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計數400倍視野下缺血側海馬CA1區凋亡陽性細胞數，每個標本取4張切片，每張切片海馬CA1區選5個不重疊的高倍視野，取平均值。

1.3.5 免疫組織化學檢測 PI3K、p-Akt，Caspase-3的表達每只動物取上述石蠟標本連續切片各3張，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組化染色和DAB顯色法顯色。每張切片在400倍視野下隨機選取缺血側海馬CA1區5個不重疊的高倍視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對結果進行定量分析，測定平均光密度值(OD)。

2 結果

2.1 白藜蘆醇預處理降低腦缺血/再灌注大鼠神經功能評分及減少腦梗死體積 I/R組大鼠神經學評分平均為2.6±0.13，明顯高于Sham組評分(P＜0.05)，而缺血前1 h進行Res預處理可明顯改善腦缺血大鼠的神經行為學障礙(P＜0.05)，見Fig 1A。TTC染色結果顯示，Sham組大鼠腦組織全部染成紅色，未發現梗死灶。I/R組大鼠缺血側梗死范圍為(37.2±3.8)%，而缺血前1 h進行Res預處理的Res+I/R組大鼠缺血側梗死范圍為(16.3±2.6)%，與I/R組大鼠缺血側梗死范圍相比明顯減少(P ＜0.05)，見 Fig 1B。

Fig 1 Effects of resveratrol pretreatment on neurological score and infarction volume

2.2 白藜蘆醇預處理明顯減少了海馬CA1區神經細胞的凋亡 經TUNEL染色和蘇木精復染后大鼠海馬CA1區凋亡細胞以細胞核染成棕黃色為主。在Sham組，海馬CA1區偶見TUNEL陽性細胞，表達于細胞核內。與Sham組比較，I/R組海馬CA1區凋亡細胞數量明顯增多(P＜0.01);而缺血前1 h進行Res預處理，可以明顯減少凋亡細胞數量(P＜0.05)，見 Fig 2A，2B。

Fig 2 Resveratrol protects neurons from focal cerebral ischemia-induced apoptosis(TUNEL staining×400)

2.3 白藜蘆醇預處理對大鼠海馬CA1區PI3K、p-Akt表達的影響 各組大鼠海馬CA1區免疫組織化學檢測結果顯示，PI3K、p-Akt蛋白的陽性細胞染色均以胞質有棕黃色物質沉積為主，并可顯示細胞輪廓。結果顯示Sham組大鼠海馬CA1區可見較多呈點狀分布的p-Akt陽性細胞，幾乎無PI3K陽性細胞。與Sham組比較，I/R組海馬CA1區PI3K陽性細胞差異沒有顯著性(P＞0.05)，但p-Akt陽性細胞數量明顯減少(P＜0.05)，見Fig 3。而缺血前1 h進行Res預處理的Res+I/R組大鼠，海馬CA1區PI3K及p-Akt表達均明顯增多(P＜0.05)，見Fig 3和Tab 1。說明Res通過誘導PI3K的表達增高進一步誘導下游p-Akt水平的增高。

Tab 1 Expressions of PI3K and p-Akt proteins in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

Tab 1 Expressions of PI3K and p-Akt proteins in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group

Group PI3K(OD)p-Akt(OD)Sham 0.167 ±0.036 0.354 ±0.056 I/R 0.161 ±0.038 0.207 ±0.055*Res+I/R 0.289 ±0.043# 0.245 ±0.045#

2.4 白藜蘆醇預處理對大鼠海馬CA1區Caspase-3表達的影響 免疫組織化學結果顯示，Sham組大鼠海馬CA1區僅見極少數Caspase-3蛋白的陽性染色胞質;腦缺血/再灌注后第5天，與Sham組比較，I/R組大鼠海馬CA1區Caspase-3表達明顯增多(P＜0.05)，見Fig 4和Tab 2，染色呈棕黃或深褐色;而在缺血前1 h進行Res預處理的Res+I/R組大鼠，海馬CA1區Caspase-3表達明顯減少(P＜0.05)，見Fig 4和 Tab 2。

Tab 2 Expression of Caspase-3 protein in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

Tab 2 Expression of Caspase-3 protein in hippocampal CA1 region(±s，n=8)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group

Group Caspase-3(OD)Sham 0.256 ±0.0923 I/R 0.552 ±0.0958*Res+I/R 0.341 ±0.0765#

3 討論

Fig 3 PI3K and p-Akt positive cells in hippocampal CA1 region shown by immunohistochemical assay(×400)

腦缺血/再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，如出現大量的氧自由基、細胞內Ca2+超載、能量障礙、興奮性氨基酸釋放增加等［9］，這些環節都可通過啟動凋亡相關基因、誘導凋亡信號轉導通路，最終導致神經元的凋亡或壞死［10］。海馬是學習記憶的重要腦區之一，海馬CA1區對缺氧缺血特別敏感［11］。和以往的研究一致，我們的實驗結果也表明，局灶性腦缺血/再灌注導致海馬CA1區神經元出現大面積凋亡。近年來的研究表明Res能夠通過多種機制對缺血性損傷發揮保護作用，包括抗氧化、清除自由基、抗凋亡等［12］。但Res具體是通過何種信號轉導機制對腦缺血/再灌注導致的海馬CA1區神經元凋亡發揮保護作用的，目前還鮮有這方面的報道。

Fig 4 Caspase-3 positive cells in hippocampal CA1 region shown by immunohistochemical assay(×400)

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是磷酸化肌醇磷脂3位羥基的激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)下游靶分子最重要的效應介質。Akt的活化直接或間接影響多種轉錄因子的表達和促凋亡蛋白活性，增強抗凋亡基因的表達和抑制細胞凋亡蛋白活性，參與生長、發育、分化和細胞的存活［13］。Noshita等［14］應用熒光雙染技術顯示腦缺血后Akt陽性細胞不是凋亡細胞，指出PI3K/Akt信號活化可以促進細胞存活減少凋亡。Lesne等［15］發現，腦缺血早期給予外源性營養因子可減少缺血腦組織的損傷，與提高缺血周圍區Akt的表達有關。本研究結果顯示，與I/R組相比，Res預處理使腦缺血大鼠海馬CA1區細胞凋亡數量明顯減少、PI3K和p-Akt數量明顯增多，這和以往的研究結果是一致的，并提示Res有類似于外源性營養因子的作用，通過激活PI3K/Akt信號轉導通路，發揮細胞存活和對抗凋亡的作用。近年來的研究發現Caspase-3參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程，它的激活是凋亡的關鍵步驟，是凋亡的最終執行者［16］。活化后的Caspase-3可以切割許多蛋白質底物，使細胞內一些參與DNA修復、mRNA剪切和DNA復制的蛋白失活，從而使細胞喪失修復功能，穩態不能正常進行。而活化的Akt通過磷酸化作用，可以抑制下游效應分子Caspase-3的活性，進而發揮調節細胞存活、增殖和分化等作用［17］。West等［18］發現 Res預處理通過減少Caspase-3的激活，對新生兒缺氧缺血性腦損傷發揮保護作用。我們實驗中也發現，局灶性腦缺血導致海馬CA1區Caspase-3表達明顯增加，Res預處理使缺血大鼠海馬CA1區Caspase-3表達明顯降低，這和以往的實驗結果是一致的。

綜上所述，本研究發現Res預處理對局灶性腦缺血/再灌注導致的大鼠海馬CA1區神經元凋亡具有保護作用。其主要作用機制可能是通過激活PI3K-Akt信號通路，使p-Akt的水平增加，進而抑制下游效應分子Caspase-3蛋白的激活來發揮神經保護作用的，但具體的機制亟待進行更深入的研究。

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