梓醇對大鼠梗死灶周圍大腦皮質神經元樹突生長及突觸素表達的影響

萬 東，祝慧鳳，羅 勇，謝 鵬

(1.重慶醫科大學附屬第一醫院急診科，重慶 400016;2.西南大學藥學院暨中醫藥學院，重慶 400716;3.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016)

腦卒中后，受損神經環路修復和重建奠定了神經缺失功能恢復的結構基礎。梗死灶周圍大腦皮質(peri-infarction cortex，PIC)幸存神經元樹突重塑、軸突再生和突觸重構是神經環路重建最關鍵的可塑性事件。迄今，神經修復藥物極其匱乏，Ⅲ期臨床試驗中，僅發現胞磷膽堿對卒中后受累肢體功能恢復有促進作用［1］。

梓醇是地黃主要的有效單體成分，具有確切的神經保護作用［2］和促神經修復潛能。課題組前期研究表明梓醇能夠促進離體培養鼠腦皮質神經元軸突生長［3］;上調缺血性腦卒中大鼠PIC區軸突生長相關蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)蛋白表達［4］，增加 PIC 區神經氈內突觸數目［5］，改善模型大鼠受累前肢感覺運動功能［6］，提示梓醇可促進卒中后軸突芽生和突觸重構，有助于受損神經環路信號輸出通道的修復重建。但梓醇能否誘導神經元樹突生長，促進神經元信息接收通道和信號整合平臺的修復重建目前尚未見相關報道。因此，本研究制備大鼠局灶缺血性腦卒中模型，觀察梓醇對模型大鼠神經缺失功能恢復、PIC區神經元樹突樹復雜程度、樹突棘密度以及突觸素p38蛋白表達的影響，明確梓醇促腦卒中后神經修復作用，探討其可能的神經機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年健康Sprague-Dawley大鼠57只，♀♂不拘，體質量(220－250)g，購自重慶醫科大學實驗動物中心(合格證號:檢動字2002A040)。隨機分為7組:假手術組，模型組，生理鹽水組，梓醇低、中、高劑量組和胞磷膽堿對照組。

1.2 藥品和器材 梓醇購于中國藥品生物制品檢定所(產品批號:110808-200508，規格:20 mg/支)。胞磷膽堿鈉注射液為山西晉新雙鶴藥業有限責任公司產品(國藥準字 H14021994，規格:125 g·L－1)。小鼠抗突觸素單克隆抗體、兔抗突觸素多克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、熒光素FITC標記羊抗小鼠IgG、堿性磷酸酶(AP)標記羊抗小鼠IgG、AP標記羊抗兔IgG以及BCIP/NBT顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。Koda顯影液和Koda定影液由重慶醫科大學校內“世強像館”饋贈。Leica-cm1850型冰凍切片機、Leica VT1000S型振動切片機為日本島津公司產品，垂直電泳槽、電泳儀、電轉槽為Bio-Rad公司產品，圖像掃描采用Scan-Maker E6系統，圖像灰度測量采用4.5.1版Quantity one圖像分析軟件。

1.3 模型制備 參照文獻［4，6－7］，采用顳側低位開顱法電凝右側大腦中動脈位于嗅束與大腦下靜脈之間的一段，制備永久性大腦中動脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)模型。假手術組除不凝閉大腦中動脈外，其余操作同模型組。

1.4 模型成功的判斷與納入標準 術后24 h，采用Bederson評分［7］評估受累肢體神經缺失功能狀況:0分，無神經功能缺失癥狀;1分，左前肢屈曲，但不伴有其他異常，即提尾懸空實驗陽性;2分，提尾懸空實驗陽性，同時側推抵抗力下降(即側向推力實驗陽性)，但自由活動時無轉圈行為;3分，同2分行為，且自由活動時向癱瘓側轉圈。評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 藥物干預 梓醇低、中、高劑量分別為1、5、10 mg·kg－1，胞磷膽堿給藥劑量為 0.5 g·kg－1。梓醇和胞磷膽堿均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3 ml。生理鹽水組經腹腔注射等體積生理鹽水。假手術組和模型組不給任何藥物干預。于術后24 h首次經腹腔注射給藥，每日1次，連續7 d。

1.6 神經行為學測試 參照文獻［8］，采用角落實驗于術前1 d測評各實驗組大鼠軀體轉向偏好，術后1 d(給藥前)、4、7和15 d評價感覺運動整合功能和姿勢不對稱運動。將兩塊大小為30 cm×20 cm×0.5 cm的硬紙板制作呈30°夾角的狹窄通道，兩塊紙板前端不完全接觸，保留0.5 cm的縫隙。行為評定時，將大鼠置于兩塊紙板中間的通道上，嘴側朝向角頂。將夾板從大鼠嘴側向尾側緩慢移動，使兩塊硬板同時觸及大鼠雙側的胡須。大鼠受到來自兩側的刺激后，會直立身體，向左或向右轉身。正常大鼠左轉身和右轉身次數基本相同;而腦卒中大鼠受肢體偏癱的影響，向病灶側(本研究為右側)轉身的次數明顯增加。每次測評時每只鼠觀察10次，記錄右轉身次數并進行統計分析。

1.7 腦梗死體積測定 參照課題組前期方法［9］，采用磁共振成像(MRI)檢測大鼠腦梗死體積。于pMCAO術后1 d(給藥前)和15 d時，采用TOSHIBA VISART 1.5T超導核磁共振成象儀，選用膝正交線圈(QD)，行頭顱T2WI掃描。測量各組大鼠腦梗死絕對體積占對側大腦半球體積的百分比，即相對腦梗死體積。

1.8 Golgi-Cox染色 依據文獻介紹［10］，配置Golgi-Cox溶液，避光靜置1 d后使用。術后15 d，假手術組、模型組、生理鹽水組、梓醇中劑量組和胞磷膽堿組各取3只大鼠，深麻醉后斷頭取腦，去除大腦額極部分，采用懸吊法將腦組織塊懸吊于100 ml Golgi-Cox溶液中，室溫避光靜置14 d后取出腦組織塊，轉入30%蔗糖溶液中浸糖2～5 d。采用振動切片機制備厚為100 μm的腦片，用Leica-cm1850型冰凍切片機制備厚度為60 μm的腦片。收集所有的腦片，采用飄浮法完成腦片顯影和定影。蒸餾水漂洗10 min后，裱片、干燥、常規脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.9 神經元樹突形態學觀察分析 參照文獻方法［11］，制定用于圖像分析的神經元入選標準:(1)細胞定位明確，整體輪廓清晰，胞體和突起著色均勻一致;(2)單個神經元的大部分樹突野清晰可辨，且聚焦在同一平面;(3)神經元的樹突分支至少可以顯示到3級或以上;(4)所選神經元不被其它神經元胞體、突起或血管遮擋。

在200倍光鏡下觀察PIC區距梗死灶邊緣1.5～2.5 mm范圍內大腦皮質錐體神經元樹突分支，1 000倍油鏡下觀察神經元樹突棘。每只大鼠采集20個錐體神經元的樹突像以備圖像分析。應用NIH ImageJ圖像分析軟件，調用“Neuron J”模塊，采用Sholl分析法(Sholl Analysis)，計量每個神經元樹突分支節點總數。樹突棘密度用每10 μm長的二、三級樹突分支上樹突棘的個數表示。每只動物分析10個神經元。

1.10 免疫熒光組織化學法檢測突觸素蛋白表達術后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后用質量分數為4%的多聚甲醛200 ml灌流固定，采集視交叉前后2 mm范圍的腦組織塊(含運動皮質區)，用質量分數為4%的多聚甲醛4℃后固定過夜，轉入質量分數為30%的蔗糖溶液脫水至組織塊沉底，速凍后連續冠狀位切片，片厚30 μm。腦片收集于0.02 mol·L－1PBS緩沖液中，用含0.3%Triton X-100(體積比)的0.02 mol·L－1PBS漂洗3次后，正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;轉移腦片至小鼠抗p38單克隆抗體工作液中(稀釋比例為1∶200)，4℃過夜(14～16 h);0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片3次后，轉移至FITC標記羊抗小鼠IgG工作液中(稀釋比例為1∶100);37℃避光孵育1 ～3 h;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片4次后，裱片，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。陰性對照用0.02 mol·L－1PBS代替小鼠抗p38單克隆抗體工作液，其余步驟相同。

1.11 Western blot檢測突觸素蛋白表達 術后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后經心臟灌注生理鹽水100 ml，斷頭取腦;冰上分離缺血灶周圍殘存大腦皮質，準確稱量0.1 g，加入1 ml 4℃預冷的胞質裂解液［成分為蔗糖 0.5 mol·L－1、HEPES 10 mmol·L－1(pH 7.9)、MgCl21.5 mmol·L－1、KCl 10 mmol·L－1、EDTA 1 mmol·L－1、甘油 10%(V/V)、DTT 1 mmol·L－1、PMSF 1 mmol·L－1、Aprotinin 5 mg·L－1、Leupeptin 5 mg·L－1］，冰上勻漿，提取胞膜和胞質蛋白。Bradford法測定抽提物中蛋白濃度。SDS-PAGE分離含40 μg蛋白的胞膜及胞質抽提物;電泳結束，電轉蛋白至PVDF膜;TTBS洗膜后，用兔抗p38多克隆抗體(稀釋比例為1∶200)和小鼠抗β-actin單克隆抗體(稀釋比例為1∶500)混合一抗工作液孵膜，4℃過夜(16～18 h);TTBS洗膜4次后，用AP標記的羊抗兔IgG(1∶15 000)和AP標記的羊抗小鼠IgG(1∶15 000)混合二抗工作液孵膜，37℃ 1 h;TTBS洗膜4次后，將膜片移入BCIP/NBT工作液中，避光顯色5～10 min;終止顯色反應后，用自來水漂洗膜片，自然晾干后掃描并采集圖像。

1.12 半定量分析 免疫熒光組織化學染色切片置于熒光顯微鏡下觀察，每只大鼠觀察3張完整無損的腦片，200倍鏡下觀察和拍攝每張腦片PIC區陽性細胞分布密集的3個不同視野，圖像轉為灰度模式后，采用NIH ImageJ圖像分析軟件測定p38陽性著色區域積分光密度值(IOD)。取同一切片背景染色定標，以減少非特異性染色和圖像采集過程中熒光參數變化影響熒光強度所造成的誤差。用各組3只大鼠共計9個視野的p38陽性著色區域平均IOD值進行統計分析。

Western blot膜片用ScanMaker E6系統掃描，并用Quantity one 4.5.1版圖像分析軟件(Bio-Rad公司產品)測定p38和內參β-actin蛋白各顯色條帶的累積光密度值(IOD值)，計算p38與對應的β-actin蛋白顯色條帶IOD值的比值，表示p38相對表達量。

2 結果

2.1 梓醇對大鼠感覺運動功能恢復的影響 角落實驗顯示，pMCAO術前各實驗組大鼠左轉次數為4.8±0.3，右轉為5.2±0.3，軀體轉向偏好組間差異無顯著性(P＞0.05)。術后1 d(給藥前)和4 d，除假手術組外，各實驗組大鼠出現明顯的神經功能缺失，右轉次數明顯增加，組間差異無顯著性(P＞0.05);術后7 d和15 d，梓醇各劑量組和胞磷膽堿組神經缺失功能明顯恢復，較對應時點模型組和生理鹽水組右轉次數明顯減少，組間差異具有顯著性(P ＜0.05)，見 Tab 1。

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

Tab 1 Numbers of right turns in the corner test among experimental groups(±s，n=6)

*P＜0.05 vs model group and normal saline group，respectively

Group Days after pMCAO 1 d 4 d 7 d 15 d Sham operation 5.2 ±0.3 5.5 ±0.2 5.3 ±0.3 5.4 ±0.5 Model 9.6 ±0.6 9.5 ±0.5 9.2 ±0.8 9.0 ±0.7 Normal saline 9.7 ±0.5 9.5 ±0.6 9.4 ±0.5 8.8 ±0.4 Low dose of catalpol 9.7 ±0.3 9.6 ±0.7 8.6 ±0.4* 8.0 ±0.3*Middle dose of catalpol 9.8 ±0.6 9.4 ±0.5 8.4 ±0.7* 7.5 ±0.5*High dose of catalpol 9.8 ±0.7 9.2 ±0.8 8.0 ±0.4* 7.0 ±0.8*Citicoline 9.6 ±0.8 9.4 ±0.7 8.5 ±0.6* 7.8 ±0.4*

2.2 梓醇對大鼠腦梗死體積的影響 MRI顯示，假手術組未見腦梗死灶，pMCAO大鼠缺血病灶累及右側大腦半球前肢感覺運動皮質和紋狀體。術后1 d和15 d，各實驗組腦梗死體積差異無顯著性(P＞0.05)，見 Fig 1。

Fig 1 Lesion volume among groups(±s，n=6)

2.3 梓醇對PIC區神經元樹突生長的影響 改良Golgi-Cox染色方法較穩定可靠，各組大鼠大腦標本均染色成功。鏡下見大腦皮質神經元胞體、軸突、軸突分支、樹突、樹突分支和樹突棘著色均勻，形態清晰可辨。圖像分析結果顯示，各實驗組PIC區神經元排列紊亂，樹突分支和樹突棘密度較假手術組明顯減少(P＜0.05);梓醇組神經元樹突分支較模型組和生理鹽水組均明顯增加(P＜0.05)，趨于假手術組水平(P＞0.05);胞磷膽堿組樹突分支數大于模型組，但差異無顯著性(P＞0.05)，且明顯少于梓醇組(P＜0.05)。各實驗組樹突棘密度變化趨勢與樹突分支的變化趨勢相似。提示腦缺血后PIC區神經元樹突分支和樹突棘密度均明顯減少;梓醇可促進神經元樹突分叉，增加樹突棘密度，見Fig 2。

2.4 梓醇對PIC區突觸素(p38)蛋白表達的影響免疫熒光組織化學染色顯示，突觸素(p38)被FITC標記，陽性著色部位呈大小較均勻的綠色小點或顆粒，主要分布在神經氈內;部分陽性顆粒圍繞在神經元周圍，襯托出神經元胞體的輪廓;部分神經元胞質內可見大量顆粒狀免疫反應產物。圖像分析顯示，梓醇中、高劑量組p38陽性著色部位IOD值均明顯高于模型組和胞磷膽堿組(P＜0.05)，見Tab 2，Fig 3;Western blot檢測結果與此基本一致，見Fig 4。提示梓醇可上調腦缺血后PIC區p38蛋白表達。

Fig 2 Golgi-Cox staining shows the changes in dendritic branches and spine density of the survival pyramidal neurons in PIC among experimental groups

Fig 3 Protein expression of P38 in the PIC among groups(FITC labelling，200×)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

Tab 2 Integral optical density(IOD)of immunoreactiveproducts of p38 in the PIC among experimental groups(±s，n=3)

▲P＜0.05 vs sham operation;△P＜0.05 vs model;◆P＜0.05 vs normal saline;◇P＜0.05 vs Citicoline

Groups Value of IOD Sham operation 35611.51 ±2564.30 Model 32869.38 ±2769.17 Normal saline 34451.26 ±3392.86 Citicoline 38545.42 ±3592.01 Low dose of catalpol 39381.25 ±4656.33△Middle dose of catalpol 54826.05 ±1566.24▲△◆◇High dose of catalpol 63940.72 ±5127.41▲△◆◇

Fig 4 Western blot analysis of the protein expression of p38 in the PIC among groups(±s，n=3)

3 討論

缺血性腦卒中后，PIC區和對側大腦半球功能相似腦區神經元軸突再生、樹突芽生和突觸重構奠定了受損神經環路修復重建的解剖學基礎［12］，直接關系到神經功能恢復狀況。但目前還缺少有效的治療藥物促進這些可塑性事件的發生。

本研究采用角落實驗觀察到，永久性腦缺血后24 h，延遲給予梓醇或胞磷膽堿干預均能促進模型大鼠感覺運動整合功能的恢復。已有研究證實［8］，角落實驗能客觀評估腦缺血模型動物慢性期的神經缺失功能，腦缺血后90 d仍能檢出感覺運動功能異常，檢驗效能和信度均高，優于神經功能評分和足失誤實驗。同時，頭顱MRI檢測證實，延遲給予梓醇干預并未有效縮小腦梗死體積，未顯示出缺血腦保護作用，提示梓醇很可能通過神經保護以外的其他藥理作用機制(如促神經修復等)發揮治療作用。

基于此，本研究采用Golgi-Cox染色發現，腦缺血損傷后15 d，缺血灶周圍幸存錐體神經元樹突分支和樹突棘密度均比假手術組明顯減少，證實腦缺血對神經元樹突產生了明顯損害。梓醇組PIC區錐體神經元樹突分支數目和樹突棘密度均比模型組明顯增加，提示梓醇可明顯促進腦缺血后神經元樹突生長，增強樹突可塑性。樹突是神經元接收、加工和整合輸入信息的基本部位。腦缺血后，神經元樹突分支和樹突棘密度減少，阻礙了神經元信息傳入，致使神經元之間的信息傳輸和細胞水平的信號整合發生障礙，是腦缺血損傷后出現神經功能障礙的重要原因［11，13］。樹突芽生和樹突棘密度增加可以提供更多表面進行突觸發生，接受更多的軸突終末，有利于已有突觸連接的細胞間形成更多的突觸，或在以前沒有突觸連接的細胞之間建立新的突觸連接，有助于病灶周圍區神經元突觸信號的傳入、處理以及受損神經環路的修復和重建;并可有效阻止PIC區失去聯系的幸存神經元因長期無法和其他細胞建立聯系而發生凋亡。可見，增強樹突可塑性可能是梓醇促進腦缺血大鼠神經功能恢復的重要神經機制。

突觸是神經細胞間相互聯系傳遞信息的結構基礎，是神經環路的基礎結構與功能單位，也是腦缺血損傷的敏感部位。腦缺血后受累神經元突觸數量減少，效能降低，神經環路信息傳遞障礙是腦缺血后出現神經功能障礙的另一重要因素［11］。突觸素p38是突觸囊泡的特異性糖蛋白，主要定位于突觸前終末內，常作為突觸重構的重要分子標志之一。樹突是神經元之間形成興奮性突觸的位置，樹突棘密度增加常常伴隨新的突觸形成和功能改善。梓醇促進樹突生長，增加樹突棘密度的同時是否伴隨突觸重構能力的增強非常值得探討。因此本研究采用免疫熒光組織化學染色和Western blot檢測了PIC區突觸素p38蛋白表達，結果發現腦缺血后15 d，梓醇組PIC區突觸素p38表達明顯強于模型組，與課題組前期研究結果相符［5］，表明梓醇可增強PIC區幸存神經元突觸重構能力，有助于神經系統信息傳遞、加工和儲存，這可能是梓醇促神經修復的另一神經機制。

此外，與既往相關報道一致［14－15］，本研究也證實胞磷膽堿可促進缺血周圍區大腦皮質神經元樹突芽生，上調突觸素表達，有助于腦卒中大鼠神經缺失功能恢復，但作用不如梓醇明顯。

總之，本研究表明，梓醇可促進腦缺血后病灶周圍皮質神經元樹突生長，增加樹突棘密度，增強突觸可塑性，為其促卒中后神經修復提供了客觀的形態學依據，并可能成為有效促進卒中后神經修復的候選藥物。

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