青蒿素對大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響及其機制

顧永偉 王 晞 黨 松 胡 娟 王 鑫 熊 亮 朱 丹

武漢大學人民醫院心內科，湖北 武漢 430060

心肌梗死后會誘導一系列炎癥反應，炎癥介質會促進心室重構的發生，主要表現為心肌纖維化，纖維化直接導致心臟舒張功能減弱，從而進展為心力衰竭[1-2]。

青蒿素是一種菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內酯類化合物，具有抗瘧疾、抗增殖、抗纖維化、抗心肌肥大的作用[3-4]。但是，青蒿素對心肌梗死后纖維化的影響及其機制目前尚不清楚。本實驗旨在觀察青蒿素對大鼠心肌梗死后心功能的影響以及對心肌纖維化相關因子，如轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ）表達的影響，從而探討青蒿素對心肌梗死后心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作

成年SD雄性大鼠，體重200～250 g（華中科技大學同濟醫學院動物中心提供）。大鼠采用3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠固定在手術臺，剪開頸部皮膚分離氣管，行氣管插管，同時將氣管插管針與小動物呼吸機連接。切開胸部皮膚分離胸大肌，剪開第2根肋骨，將心臟暴露，在肺動脈圓錐和左心耳之間結扎冠狀動脈。結扎成功后缺血區心肌組織變白，同時心電圖對應的導聯抬高。假手術組只進行開胸和分離冠狀動脈但是不結扎。術后24 h將心肌梗死模型制備成功的大鼠隨機分為對照組和青蒿素組。青蒿素組按照75 mg/(kg·d)劑量灌胃，每日3次。對照組和假手術組灌胃等量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，治療4周后檢測心功能和纖維化相關指標。

1.2 超聲心動圖和血流動力學檢測

心肌梗死后4周利用超聲心動圖檢測心臟結構和功能的變化。超聲檢查前，每只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉，然后檢測乳頭肌水平胸骨旁短軸切面，分別測量左心室舒張末期內徑 （left ventricle end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內徑（left ventricle end systolic dimension，LVESD）、左心室射血分數（eject fraction，EF）以及左心室短軸縮短率（fractional shortening，FS）。血流動力學檢測時，將微導管從大鼠右頸總動脈插入左心室，同時記錄左心室收縮末壓 （left ventricular end-systolic pressure，LVESP）和左心室舒張末壓（left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP）以及壓力上升最大速率（dp/dtmax）。

1.3 免疫組織化學分析心肌梗死面積和心肌纖維化

心肌梗死后4周，取出大鼠心臟放入10%濃度的福爾馬林溶液中固定，取左心室長軸以下部分石蠟包埋，切取4 μm厚的截面標本行Mallory-Azan染色，用圖像分析軟件測定梗死面積并取均值。Mallory-Azan染色切片用來定量測定血管周圍心肌纖維化面積，每個心臟取10個視野然后取其平均值。

1.4 Western blot檢測TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達

分別取梗死邊緣區和假手術組對應區心肌組織提取蛋白。各取等量的蛋白樣品，加入10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后通過電轉將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，將膜置入10%脫脂奶粉中室溫封閉20 min，再加入1∶1000稀釋的一抗（TGF-β1兔抗鼠和collagen typeⅠ兔抗鼠），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入1∶20的二抗37℃孵育1 h，然后再用TBST洗膜3次。將膜同ECL反應，1～5 min后曝光于X光膠片上。通過光密度軟件分析，將目的條帶值與β-actin值比較，相對值為TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達水平。

1.5 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物生存率和心肌梗死面積比較

心肌梗死后4周，假手術組生存率顯著高于對照組和青蒿素組；與對照組比較，青蒿素組生存率顯著提高（65%vs 40%，P＜0.05）；對照組與青蒿素組大鼠心肌梗死面積差異無統計學意義[（41.00±4.40）%vs （38.38±4.36）%，P ＞ 0.05]。

2.2 超聲心動圖和血流動力學檢查結果

心肌梗死后4周，對照組和青蒿素組LVEDP、LVESD、LVEDD與假手術組比較顯著增加，而FS和dP/dtmax則顯著降低，表明心肌梗死模型制備成功。青蒿素治療組與對照組比較，LVEDP、LVESD、LVEDD 顯著縮小，而 FS 和 dP/dtmax顯著增加（P<0.05）。 見表 1。

2.3 梗死周邊區心肌纖維化變化情況

梗死周邊區心肌纖維化導致心肌僵硬舒張功能減弱，惡化心功能。本研究通過對組織切片行Mallory-Azan染色，然后定量分析，發現青蒿素治療組和對照組的血管周圍纖維化范圍與假手術組比較顯著增加（P<0.05），但是青蒿素治療組與對照組比較顯著減輕（P<0.05）。見圖1。

2.4 梗死周邊區心肌組織TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達情況

心肌梗死后4周發現，對照組和青蒿素組TGF-β1蛋白表達與假手術組比較顯著增高（P<0.05），而青蒿素組TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白表達水平顯著低于對照組（P<0.05）。見圖2。

表1 超聲心動圖和血流動力學檢測（）

表1 超聲心動圖和血流動力學檢測（）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與對照組比較，&P＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

圖1 心肌梗死后4周，血管周圍纖維化面積定量分析

3 討論

本研究發現青蒿素具有抑制心肌梗死后心室重構改善心功能提高生存率的作用。青蒿素對心肌梗死后心臟的保護作用主要通過抑制心肌梗死后的炎癥因子的表達、心肌纖維化的進程，從而緩減心室重構。

心肌梗死后伴有心室重構的發生，其中包括左室腔的擴大和功能的改變。心室重構是一個慢性進展性過程，其中包括非梗死區心肌細胞的肥大、細胞外基質合成增加、心肌間質纖維化程度的加劇，最終導致心室腔的擴大[5]。這種病理性重構導致心臟功能障礙，已成為心肌梗死后患者致殘和致死的獨立危險因素[6]。本實驗筆者通過建立大鼠心肌梗死模型觀察青蒿素對大鼠心肌梗死后心功能以及生存率的影響。青蒿素治療4周后筆者發現，青蒿素組與對照組比較生存率和心功能顯著增加（P<0.05），心臟結構重構得到顯著緩減。研究結果表明，青蒿素具有潛在抑制心肌梗死后心室重構的作用。

圖2 Western blot分析梗死周邊區心肌組織TGF-β1及collagen typeⅠ的表達水平

心肌梗死后壞死的細胞誘導炎癥反應產生大量的炎癥因子，這些炎癥因子促進心肌纖維化，加劇心室重構。NF-κB是調控炎癥反應的關鍵轉錄因子[7]。心肌梗死后NF-κB信號通路被激活，誘導炎癥反應，釋放大量炎癥因子，如TGF-β1。TGF-β1在心肌纖維化的過程中起著重要的作用，它可以調控成纖維細胞分化為肌纖維母細胞，肌纖維母細胞促進膠原和細胞外基質的合成，導致心肌纖維化程度加重，心肌僵硬度增加，心室舒張功能障礙[8]。本研究發現青蒿素可以顯著減輕心肌間質纖維化，同時也減少TGF-β1和collagen typeⅠ蛋白的表達，表明青蒿素通過下調TGF-β1蛋白表達，減少心肌纖維化，改善心臟功能。

總之，青蒿素可以抑制心肌梗死后心室重構，增強心功能。青蒿素的心臟保護作用可能是通過下調TGF-β1蛋白的表達，減少心肌纖維化實現的。

[1]YamamotoK，MasuyamaT，SakataY，etal.Myocardialstiffnessisdetermined by ventricular fibrosis，but not by compensatory or excessive hypertrophy in hypertensive heart[J].Cardiovasc Res，2002，55，76-82.

[2]Kuwahara F，Kai H，Tokuda K，et al.Hypertensive myocardial fibrosis and diastolic dysfunction：another model of inflammation[J].Hypertension，2004，43（4）：739-745.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：化學工業出版社，2005：309.

[4]郭燕，王俊，陳正堂.青蒿素類藥物的藥理作用新進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2006，11（6）：615-618.

[5]Cohn JN，Ferrari R，Sharpe N.Cardiac remodeling–concepts and clinical implications：a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling-behalf of an international forum on cardiac remodeling[J].J Am Coll Cardiol，2000，35：569-582.

[6]MannDL.Mechanismsandmodelsinheartfailure：acombinatorialapproach[J].Circulation，1999，100：999-1008.

[7]Barnes PJ，Karin M.Nuclear factor-kappaB： a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases[J].N Engl J Med，1997，336：1066-1071.

[8]Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue brosis[J].N Engl J Med，1994，331：1286-1292.