金橙G共振光散射法測定脫氧核糖核酸

高雪敏，李生泉，樊瑋鑫，郝桂青

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，山西 太谷 030801)

脫氧核糖核酸(DNA)是重要的生物大分子，也是遺傳信息的載體和基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。核酸的定量測定可為生物體體液中其它組分的測定及遺傳疾病的診斷提供重要信息，因而成為人們關(guān)注和研究的重要課題。

目前，測定核酸的常用方法有化學(xué)發(fā)光法[1～3]、光度分析法[4～6]、熒光分析法[7,8]、共振光散射(RLS)法[9,10]及電化學(xué)法[11,12]等。共振光散射法是一種新的光譜分析技術(shù)，因其靈敏度高、操作簡單，越來越受到分析工作者的重視。金橙G(OG)是一種偶氮類生物染色劑，利用其共振光散射信號測定DNA的方法尚未見報道。基于DNA可以增強OG的共振光散射信號，且在一定范圍內(nèi)其增強值與DNA的濃度呈線性關(guān)系，作者建立了一種定量測定DNA的共振光散射法，并用于測定合成樣品中DNA的含量。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

OG儲備溶液 (1×10-3mol·L-1)；鯡魚精DNA(hsDNA，100 μg·mL-1)，4 ℃冰箱保存，使用時稀釋。所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

RF-5301型熒光分光光度計，日本島津；pHS-3C型pH計，上海世義精密儀器有限公司。

1.2 方法

在10 mL 容量瓶中依次加入OG 0.4 mL、一定量的hsDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二次蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置 5 min。選擇激發(fā)狹縫寬度為5 nm、發(fā)射狹縫寬度為5 nm，于λem=λex=358 nm處，分別測定樣品溶液共振光散射強度I和參照溶液共振光散射強度I0，并根據(jù)△I=I-I0計算DNA對OG共振光散射強度的增強值△I。

2 結(jié)果與討論

2.1 共振光散射(RLS)光譜特征

考察了不同激發(fā)波長下OG的散射光譜，見圖1。

cOG=4×10-5 mol·L-1 1～3.λex=300 nm,350 nm,400 nm

從圖1可以看出，OG有較強的共振瑞利散射和微弱的拉曼散射。進一步考察了不同DNA濃度的OG-DNA體系在λem=λex下同步掃描的共振光散射光譜，見圖2。

cOG=4.0×10-5 mol·L-1 1～6,cDNA(μg·mL-1):0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5

從圖2可以看出，OG本身的RLS信號較弱，在加入DNA后，其RLS信號明顯增強，且隨著DNA濃度的不斷增大，△I也在增大，在241 nm、297 nm、358 nm附近出現(xiàn)了增強的共振光散射特征峰，其中358 nm處△I值最大。因此，實驗選擇358 nm為工作波長。

2.2 OG濃度的選擇

考察了1.0×10-6～1.0×10-3mol·L-1范圍內(nèi)不同濃度OG的共振光散射強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為4.0×10-5mol·L-1時，OG的共振光散射強度達到最大。因此，實驗選擇OG的工作濃度為4.0×10-5mol·L-1。

2.3 介質(zhì)酸度的選擇

考察了pH值在3.0～12.0 范圍內(nèi)不同pH值對△I的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值在5.8～9.0范圍內(nèi)，△I值比較穩(wěn)定，其中pH值為7.0時△I值最大，因此，實驗選擇 pH值為7.0，不需要加入任何緩沖溶液。

2.4 反應(yīng)時間的選擇

考察了反應(yīng)時間對樣品溶液△I的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品溶液的△I在反應(yīng)5～60 min保持穩(wěn)定，因此，實驗選擇反應(yīng)時間為5 min。

2.5 反應(yīng)溫度的選擇

在10～40 ℃范圍內(nèi)考察了反應(yīng)溫度對△I的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20～26 ℃范圍內(nèi)，△I值基本沒有變化且達到了最大值，27 ℃時有所下降。30 ℃之后則迅速下降，因此，實驗選擇在室溫下進行。

2.6 線性范圍和檢出限

用100 μg·mL-1的hsDNA儲備液配制一系列hsDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述最佳的反應(yīng)條件下，按實驗方法測定樣品的△I值，當(dāng)DNA的質(zhì)量濃度為0.053～1.20 μg·mL-1時(線性范圍下限采用10σ法)，體系的△I值與DNA質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為：△I=968.9c，相關(guān)系數(shù)R2=0.9909。方法的檢測限為0.0159 μg·mL-1(3σ法)。

2.7 共存物質(zhì)的影響

最佳實驗條件下，考察了共存物質(zhì)對0.8 μg·mL-1的DNA測定的影響，在相對誤差±5%范圍內(nèi)，可允許存在的各種物質(zhì)的濃度倍數(shù)分別為： Ca2+(50)、Cr3+(100)、Mg2+(1000)、Na+(1500)、K+(1500)、Cu2+(40)、Fe3+(2)、Al3+(3)、Zn2+(150)、F-(1500)、I-(600)、三乙醇胺(1000)、葡萄糖(600)。Fe3+和Al3+對測定干擾較大，這是因為Fe3+和Al3+能和DNA發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。實際測定中，可用F-掩蔽Fe3+，用三乙醇胺掩蔽 Al3+。

2.8 樣品分析

為了檢驗方法的適用性，根據(jù)共存物質(zhì)的干擾特性，合成了3個含不同干擾組分的樣品。測定結(jié)果見表1。

表1 合成樣品的測定結(jié)果(n=7)

由表1可知，回收率在98.6%～102.3%之間，可用于合成樣品中DNA的測定。

3 結(jié)論

提出了OG共振光散射法測定DNA的新方法。在pH值為7.0、OG濃度為4.0×10-5mol·L-1、室溫下反應(yīng)5 min后測定合成樣品中微量hsDNA的含量，結(jié)果令人滿意。該方法簡便、快速、檢出限低，在微量DNA的分析測定中有著良好的發(fā)展前景。

[1] 李兆強,陳荔榕.化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)在生命科學(xué)研究中的一些應(yīng)用[J].世界科技研究與發(fā)展,2004,26(4):14-23.

[2] 何治柯,羅慶堯,曾云鶚.化學(xué)發(fā)光分析進展[J].分析測試學(xué)報,1997,16(1):72-84.

[3] 武鑫,李生泉,劉金龍.DNA的定量分析方法進展[J].化學(xué)與生物工程,2009,26(7):11-15.

[4] 欒吉梅,張曉東.生物探針與脫氧核糖核酸的結(jié)合模式及其分光光度法測定的進展[J].理化檢驗-化學(xué)分冊,2006,42(11):964-968.

[5] 李韌韜,龍云飛,張永婷,等.天青Ⅰ分光光度法測定DNA[J].光譜實驗室,2004,21(2):300-302.

[6] 蔡朝霞,宋功武,王世敏.核酸探針光化學(xué)分析研究進展[J].化學(xué)與生物工程,2003,20(5):19-22.

[7] 李文友,吳會靈,何錫文,等.中性紅熒光探針法測定生物大分子核酸[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,2003,24(10):1787-1789.

[8] 俞英,吳霖,譚麗賢.堿性品紅熒光法測定脫氧核糖核酸及其機理的研究[J].分析化學(xué),2004,32(5):628-632.

[9] 高峰,章麗,李永新,等.溴代十六烷基三甲基銨敏化吡羅紅B-核酸作用的共振光散射增強法測定核酸[J].分析科學(xué)學(xué)報,2005,21(6):623-626.

[10] 高峰,杜俊,章麗.陰離子表面活性劑與酚藏花紅的作用及其在核酸熒光法測定中的應(yīng)用[J].應(yīng)用化學(xué),2004,21(7):722-726.

[11] 牛淑妍,張書圣,馬立波,等.茜素紅S與脫氧核糖核酸相互作用的電化學(xué)研究[J].分析化學(xué),2004,32(9):1234-1236.

[12] 王振永,焦奎,孫偉,等.燦爛甲酚藍電化學(xué)探針測定脫氧核糖核酸[J].青島科技大學(xué)學(xué)報,2005,26(1):6-9.