白藜蘆醇對視網膜母細胞瘤SO-Rb50增殖抑制作用的觀察

崔 平， 李軍會， 南 娜， 康 潔， 申景然

(1.河北省人民醫院醫務處，河北石家莊050051;2.石家莊麥格明目眼科門診部，河北石家莊050031;3.河北醫科大學第四醫院眼科，河北石家莊050011;4.河北省人民醫院眼科，河北石家莊050051)

白藜蘆醇 (resveratrol，Res)是近年來發現的具有多種生物活性的多酚化合物。近年來，已經證實白藜蘆醇具有調節脂質代謝、抑制血小板聚集保護心血管、抗炎等多種生物活性和藥理作用，對多種腫瘤 (如鼠肝細胞癌、乳腺癌等)也具有不同程度的抑制作用［1-2］，但對視網膜母細胞瘤的作用研究少見報道。本實驗以人視網膜母細胞瘤細胞為研究對象，觀察白藜蘆醇對其增殖的影響，并初步闡明具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

人視網膜母細胞瘤細胞SO-RB50:購自美國ATCC菌種保藏中心。白藜蘆醇、MTT、DMSO購自美國Sigma公司;RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH一抗均購自美國 Santa Cruz公司;PCNA、Cyclin D、Rb、P16、GAPDH引物根據GenBank序列設計并委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCNA上游引物:5'-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3'，下游引物:5'-GCAATTTTATACTCTACAACAAGGGG-3'，片段長度302 bp。

Cyclin D1上游引物:5'-CTTCCTCTCCAAAATGCCAG-3'，下游引物:5'-AGAGATGGAAGGGGGAAAGA-3'，片段長度550 bp。

Rb上游引物:5'-CAGACTGATTCTATAGACAG-3'，下游引物:5'-GTTTGTATCGCTGTGATCC-3'，片段長度327 bp。

P16上游引物:5'-CCTGGCTCTGACCATTCTGT-3'，下游引物:5'-GTCCTCACCTGAGGGACCTT-3'，片段長度347 bp。

GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，片段長度452 bp。

1.2 細胞增殖抑制實驗 采用MTT法進行檢測，具體如下:以104個細胞/孔的密度將視網膜母細胞瘤細胞SORB50接種于96孔板，藥物處理組分別加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇，對照組加0.5%DMSO，每組6個復孔。分別孵育24 h和48 h，在實驗結束之前4 h，每孔加入20 μL MTT，繼續孵育4h，實驗結束后，離心棄去培養液，每孔加入DMSO 150 μL，于室溫輕微溶解結晶15 min，用酶標儀測定吸光度OD490值。

1.3 細胞周期分析 視網膜母細胞瘤SO-RB50細胞分別加入6.25、12.5、25、50、100 μmol/L 白藜蘆醇孵育48 h，經胰酶消化后收集細胞并在細胞中加入1 mL 70%的乙醇，混勻，上Becton Dickinsor FACscan流式細胞儀檢測 SORB50細胞周期分布情況。

1.4 RT-PCR檢測 視網膜母細胞瘤SO-RB50細胞加入50 μmol/L白藜蘆醇，對照組加入等體積0.5%DMSO孵育24 h后收集細胞，按照Trizol試劑說明書，采用一步法提取各組細胞總RNA。在測定完總RNA濃度和純度后，取等量RNA進行反轉錄制備cDNA。之后在Taq酶的作用下進行PCR反應，擴增目的片段。PCR參數設置為預變性95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 30 s，在完成25個循環后，72℃延伸10 min。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(80 V 1 h)分離，結果用凝膠成像分析系統進行圖像掃描及密度分析。以GAPDH條帶作為內參照，以目的片段條帶密度值/GAPDH條帶密度值的比值進行分析。

1.5 Western blot分析 視網膜母細胞瘤SO-RB50細胞加入50 μmol/L白藜蘆醇，對照組加入等體積0.5%DMSO孵育48 h后收集細胞，加入冰的細胞裂解液提取細胞總蛋白，定量完畢，實驗組和對照組均取60 μg蛋白樣品煮沸變性后，進行10%SDS-PAGE電泳。根據蛋白marker的指示，將含有目的條帶的凝膠轉到PVDF膜上，依次進行:5%脫脂奶粉室溫1 h;相應一抗4℃過夜;TBST漂洗3次后加相應二抗37℃ 1.5 h;TBST漂洗3次后，ECL發光法顯色;最后對條帶進行吸光度積分掃描。以GAPDH條帶作為內參照，以目的片段條帶密度值/GAPDH條帶密度值的比值進行分析。

2 結果

2.1 對視網膜母細胞瘤細胞增殖活性的影響 MTT分析檢測結果表明，在 6.25、12.5、25、50 μmol/L濃度范圍內的白藜蘆醇作用24h及48h，均能抑制SO-RB50細胞增殖，且抑制效應與白藜蘆醇作用濃度呈依賴關系。其中50 μmol/L白藜蘆醇處理視網膜母細胞瘤細胞48 h時抑制作用已較為明顯，而100 μmol/L濃度并不能使抑制作用進一步增強 (均P＜0.05)。見表1。

表1 白藜蘆醇對人視網膜母細胞瘤SO-RB50細胞OD值的影響(%，±s，n=6)

表1 白藜蘆醇對人視網膜母細胞瘤SO-RB50細胞OD值的影響(%，±s，n=6)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

劑量/(μmol·L-1)24 h 48 h對照組1.58 ±0.39 1.67 ±0.386.25 1.16 ±0.31 1.12 ±0.29*12.5 1.01 ±0.29* 0.93 ±0.36＊＊25 0.97 ±0.23＊＊ 0.89 ±0.25＊＊50 0.84 ±0.26＊＊ 0.76 ±0.26＊＊100 0.86 ±0.15＊＊ 0.79 ±0.24＊＊

2.2 細胞周期分析 流式細胞術結果顯示，12.5、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇處理后，SO-RB50細胞周期分布發生了改變，即處于 G1期的SO-RB50細胞數明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，處于S期的SO-RB50細胞數顯著減少 (P＜0.05，P ＜0.01)。見表2。

2.3 對視網膜母細胞瘤細胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達的影響 RT-RCR結果顯示，50 μmol/L白藜蘆醇作用視網膜母細胞瘤細胞48 h后，視網膜母細胞PCNA和Cyclin D mRNA表達水平顯著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和 P16 mRNA水平顯著上升 (P＜0.01)。見表3，圖1。

表2 白藜蘆醇作用對SO-RB50細胞周期分布的影響(±s，n=6)

表2 白藜蘆醇作用對SO-RB50細胞周期分布的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

劑量/(μmol·L-1) G1期/% S期% G2/M期/%對照組12.2 ±5.656.7 ±7.8 26.8 ±5.2 16.5 ±4.66.25 62.9 ±8.2 22.5 ±6.5 14.6 ±4.512.5 68.4 ±9.8* 19.2 ±3.5* 12.4 ±3.625 76.1 ±10.1＊＊ 11.6 ±3.3＊＊ 12.3 ±4.750 78.8 ±11.9＊＊ 10.1 ±2.8＊＊ 11.1 ±5.4100 77.3 ±9.9＊＊ 10.5 ±3.1＊＊

表3 白藜蘆醇對SO-RB50細胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達的影響(±s，n=6)

表3 白藜蘆醇對SO-RB50細胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA表達的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01。

mRNA PCNA Cyclin D Rb P16對照組組別1.38 ±0.34 0.83 ±0.19 0.09 ±0.02 0.29 ±0.07白藜蘆醇組 0.43 ±0.08＊＊0.38 ±0.08＊＊0.60 ±0.13＊＊ 1.02 ±0.28＊＊

圖1 PCNA、Cyclin D、Rb和P16 mRNA的表達情況(RT-PCR)

2.4 對視網膜母細胞瘤細胞 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，50 μmol/L白藜蘆醇處理視網膜母細胞瘤細胞48 h后，PCNA和Cyclin D蛋白水平顯著下降 (P＜0.01)，抑癌基因Rb和P16蛋白水平顯著上升 (P＜0.01)。見表4，圖2。

表4 白藜蘆醇對SO-RB50細胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達的影響(±s，n=6)

表4 白藜蘆醇對SO-RB50細胞PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白表達的影響(±s，n=6)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01。

PCNA Cyclin D Rb P16對照組組別 蛋白0.96 ±0.25 0.95 ±0.17 0.33 ±0.04 0.30 ±0.06白藜蘆醇組 0.38 ±0.05＊＊0.51 ±0.06＊＊0.87 ±0.14＊＊ 0.78 ±0.13＊＊

3 討論

圖2 PCNA、Cyclin D、Rb和P16蛋白的表達情況(Western blot)

由于放化療等措施對于機體的副作用大，且在許多惡性腫瘤的治療中治療效果有限，故近年來中藥提純物作為惡性腫瘤輔助治療藥物受到了越來越多的關注，且研究已取得許多成果［3-4］。視網膜母細胞瘤 (retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見的眼內惡性腫瘤，其發生主要是由于Rb基因的缺失或失活導致細胞周期調控異常所致。RB生長迅速、惡性度高、轉移早，嚴重危害患兒的視力及生命。有研究表明，白藜蘆醇可明顯抑制不同癌細胞增殖，但是，筆者未見到關于白藜蘆醇是否影響人視網膜母細胞瘤細胞增殖的報道。本研究發現，6.25～100 μmol/L范圍內白藜蘆醇均能顯著抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖，且抑制效應與白藜蘆醇的作用時間呈依賴關系。隨后進行了流式細胞術以明確白藜蘆醇對視網膜母細胞瘤細胞周期的具體影響，結果顯示，不同濃度的白藜蘆醇作用后，處于G1期的SORB50細胞數明顯增加，處于S期的SO-RB50細胞數顯著減少，且50 μmol/L白藜蘆醇作用48 h時變化最明顯，提示白藜蘆醇具有明顯的抗人視網膜母細胞瘤細胞增殖的作用，這一作用是白藜蘆醇通過調控腫瘤細胞周期實現的。

本研究為探討白藜蘆醇抑制人視網膜母細胞瘤增殖的機制，檢測了與細胞周期密切相關的蛋白，這些調節因子的表達失衡可導致腫瘤的發生。其中，PCNA能夠反映細胞增殖分數和所處周期的客觀指標，也可以作為判定腫瘤的惡性程度及預后的重要指標［5］;CyclinD1是細胞周期重要的正調控因子，在腫瘤的發生發展過程中起著重要的促進作用［6］，若CyclinD1基因發生改變，則有可能導致細胞周期的異常調控，進而導致細胞轉化甚至癌變［7］。我們的結果顯示用藥前SO-RB50細胞呈現PCNA、Cyclin D高表達，應用白藜蘆醇后PCNA、Cyclin D表達均下調，結合FCM所測得的細胞周期結果，表明白藜蘆醇是通過下調PCNA、Cyclin D發揮抗腫瘤的作用。

臨床中視網膜母細胞瘤的發生是一個涉及多重基因事件的復雜過程，僅一種癌基因缺失或突變不足以導致腫瘤的發生和發展，而是多個激活的癌基因與失活的抑癌基因之間的協同作用的結果，因此我們進一步研究了白藜蘆醇對抑制癌基因的作用。Rb和P16均是重要的抑制癌基因。Rb對細胞周期的調控作用主要是通過和E2F結合，從而阻止細胞從G1期進入S期，使細胞周期停滯［8-9］。P16基因是近年研究發現的多種腫瘤抑制基因，作為細胞周期素依賴性激酶 (CDK)的抑制蛋白，與細胞周期蛋白共同推進細胞周期進程，它的失活或缺失，會導致CDK過度作用，造成細胞非正常增殖［10］。我們的研究表明白藜蘆醇作用后抑癌基因Rb和P16 mRNA和蛋白表達均顯著下降，結合細胞周期相關因子PCNA、Cyclin D的結果進行綜合分析，我們認為白藜蘆醇可體外抑制SO-RB50增殖，其抑制作用是通過抑制PCNA和Cyclin D轉錄和翻譯、促進Rb和P16轉錄和翻譯，進而抑制細胞周期進程實現的。但闡明白藜蘆醇抗SO-RB50腫瘤活性機制仍需進一步研究。

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