RP-HPLC法同時測定痛經(jīng)寧膠囊中4種有效成分

2012-07-26 11:35:12黃文君龍鳳榮

中成藥 2012年11期

黃文君，龍鳳榮，伍慶，乙引，洪江

(1.貴州師范大學(xué)，貴州貴陽550001;2.貴州弘康藥業(yè)有限公司，貴州貴陽550001;3.貴州科學(xué)院，貴州貴陽550001)

痛經(jīng)寧膠囊由白芍、丹參、當(dāng)歸等九味藥材組成，具有活血化瘀，行氣散寒，調(diào)經(jīng)止痛等功效，用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)前、行經(jīng)期腹痛等［1-2］。目前，對痛經(jīng)寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，主要是針對芍藥苷的定量測定［3］，該方成分復(fù)雜多樣，單指標(biāo)難以有效反應(yīng)制劑質(zhì)量。丹參活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神，為方中臣藥，其水溶性活性成分丹參素理氣止痛，原兒茶醛可抑制血小板凝聚，丹酚酸B活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)［4-6］，均為該制劑有效成分。為了更好的控制痛經(jīng)寧膠囊的質(zhì)量，故本實驗選擇丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和芍藥苷為檢測對象，經(jīng)過對色譜條件的摸索與優(yōu)化，建立了RP-HPLC法同時測定痛經(jīng)寧膠囊中丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B 4種有效成分。該法簡單快速、穩(wěn)定可靠，為更好的控制該制劑質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent色譜工作站 (安捷倫科技有限公司);CH—250超聲波清洗儀 (北京創(chuàng)新德超聲電子研究所);XS205DU電子分析天平 (梅特勒-托利多)。

1.2 試藥丹參素鈉對照品 (批號:110855-200507)、原兒茶醛對照品 (批號:110810-200506)、芍藥苷對照品 (批號:110736-200629)、丹酚酸B對照品 (批號:111562-200803)均購于中國藥品生物制品檢定所。痛經(jīng)寧膠囊為市售(批號:20110301，20110401，20110801，貴州弘康藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水 (自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-乙腈 (2∶1)(A)-0.05%磷酸水溶液 (B)，梯度洗脫 (0 min，7%A;15 min，22%A;30 min，31%A;50 min，53%A)，體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長230 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取原兒茶醛對照品6.52 mg置10 mL量瓶中，加稀乙醇 (529→1000，下同)稀釋至刻度，制成0.652 mg/mL的對照品溶液。精密稱取對照品丹參素鈉8.78 mg、芍藥苷10.41 mg、丹酚酸B 5.72 mg，精密吸取上述原兒茶醛對照品溶液0.5 mL置于同一25 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，制成丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為0.3512 mg/mL、0.01304 mg/mL、0.4164 mg/mL 和0.2288 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液1 mL于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸 B質(zhì)量濃度分別為 70.24 μg/mL、2.608 μg/mL、83.28 μg/mL 和 45.76μg/mL 的混合對照品溶液，供定量測定用。

2.2.2 供試品溶液的制備取痛經(jīng)寧膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備參照制劑的工藝過程，按處方比例分別配置不含白芍和丹參的陰性樣品，照2.2.2項下方法操作，制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷、丹酚酸B的理論塔板數(shù)均不低于10000，與相鄰成分達(dá)到基線分離，且陰性對照無干擾。對照品、樣品與陰性樣品的色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系試驗分別精密吸取上述混合對照品貯備液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于5 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積值(Y)對進(jìn)樣量 (X，μg)進(jìn)行線性回歸，得丹參素鈉回歸方程為 Y =953.53X －2.6216(r=0.9999);原兒茶醛回歸方程為 Y=5022.6X+1.8974(r=0.9996);芍藥苷回歸方程為Y=1285.2X+2.9049(r=0.9998);丹酚酸B回歸方程為Y=1995.1X+12.878(r=0.9999)。結(jié)果表明，丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B分別在 0.14048 ～1.4048 μg，0.00522 ～0.0522 μg，0.16656 ～1.6656 μg 和 0.09152 ～0.9152 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 對照品 (A)、樣品 (B)、丹參陰性樣品 (C)和白芍陰性樣品 (D)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)， sample(B)，negative sample without Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma(C)and negative sample without Paeoniae Radix alba(D)

2.5 精密度試驗精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計算RSD值，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B的RSD分別為0.82%、1.43%、0.96%和1.61%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.45%、1.26%、0.98%和1.83%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗取同一批號 (20110801)痛經(jīng)寧膠囊內(nèi)容物粉末，照2.2.2項下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算含有量，結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B含有量的RSD分別為1.12%、2.03%、0.76%、1.58%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含有量的痛經(jīng)寧膠囊 (批號:20110801)9份，每份約0.15 g，置25 mL量瓶中，分別精密加入上述混合對照品貯備液1.6、2.0、2.4 mL，各平行3份，加稀乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用稀乙醇加至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測定取3批樣品，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算各自質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇經(jīng)紫外-可見分光光度計掃描，丹參素鈉分別在207、221、282 nm處有吸收峰，原兒茶醛分別在207、231、280、312 nm處有吸收峰，芍藥苷分別在202、230、275 nm處有吸收峰，丹酚酸B分別在206、224、254、286、308 nm處有吸收峰。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［7-8］，本實驗比較了230 nm與280 nm波長下樣品的吸收，實驗結(jié)果表明采用230 nm同時測定4種成分時的響應(yīng)值和峰形優(yōu)于采用280 nm測定結(jié)果。

3.2 提取條件的選擇由于丹酚酸B的熱不穩(wěn)定性［9］，故選擇超聲提取。丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B均為水溶性成分，本實驗考察了純水，稀乙醇，95%乙醇，50%甲醇及80%甲醇的提取效果，結(jié)果表明，稀乙醇與50%甲醇優(yōu)于其他溶劑，二者對丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷的提取率相當(dāng)，而稀乙醇對丹酚酸B的提取率高于50%甲醇;進(jìn)一步試驗，以稀乙醇為提取溶劑，分別超聲提取20、30、45 min，發(fā)現(xiàn)超聲提取30 min各組分均可提取完全。故本實驗選擇稀乙醇作提取溶劑超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.3 流動相的選擇由于丹參素鈉、原兒茶醛、芍藥苷和丹酚酸B均為酸性化合物，為改善其拖尾現(xiàn)象，故在流動相中加入酸來改善峰形，而醋酸在230 nm有吸收，容易發(fā)生基線的漂移，因此選擇加入磷酸，同時結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料［10-13］，也比較了甲醇與乙腈的分離效果，選擇了甲醇-乙腈(2∶1)(A)－0.05%磷酸 (B)系統(tǒng)，經(jīng)梯度洗脫優(yōu)化，最終確定了上述最佳流動相。