多指標正交實驗優選旋覆代赭湯最佳煎煮工藝

汪 斌， 秦昆明，2， 姚仲青， 蔡寶昌，2*

(1.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇南京210061;2.南京中醫藥大學，江蘇南京210029)

旋覆代赭湯出自東漢張仲景的《傷寒雜病論》，是中醫臨床常用湯劑之一，廣泛用于治療反流性食管炎［1-2］、膽汁反流性胃炎［3-4］、頑固性呃逆［5］等疾病。原方由旋覆花、人參、代赭石、甘草、半夏、大棗、生姜七味藥組成，本方臨床運用歷史悠久，療效確切，現代藥理學研究表明，旋覆代赭湯中旋覆花、代赭石和大棗對大鼠胃底條肌收縮具有顯著促進作用，旋覆花與甘草、大棗分別合用，有明顯協同促進作用［6］。另有文獻顯示旋覆花中綠原酸能顯著增加大鼠消化道的蠕動，提高平滑肌張力，人參和甘草對實驗性胃潰瘍有一定的治療和預防作用，松弛胃腸道平滑肌，減少胃酸分泌［7］。于強，劉彬等研究發現旋覆代赭湯可以顯著提高血漿胃動素水平，促進胃排空，防治酸反流，進而達到臨床對功能性消化不良癥治療的目的［8-9］。但是，方劑臨床療效的發揮與方劑的煎煮工藝密切相關，目前尚沒有報道對旋覆代赭湯的煎煮工藝進行系統的研究。本實驗對旋覆代赭湯的煎煮工藝進行了系統研究，采用雙波長高效液相色譜法，建立同時測定旋覆代赭湯中5種主要成分綠原酸、甘草酸和人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的測定方法，并通過正交實驗設計優化煎煮工藝，為臨床煎煮旋覆代赭湯的規范化提供合理的依據。

1 實驗器材

1.1 儀器 日本島津LC—20AB高效液相色譜儀系統，RE—52型旋轉蒸發儀，KQ5200DB型數控超聲儀，80—2型臺式低速離心機。

1.2 藥品與試劑 綠原酸標準品 (批號:110753-200413)，甘草酸銨標準品 (批號:110731-200615)，人參皂苷 Rg1標準品 (批號:110703-200726)，人參皂苷 Re標準品 (批號:110754-200822)，均購自中國藥品生物制品檢定所;人參皂苷Rb1標準品 (批號:11072432)，購自上海同田生物制品有限公司;旋覆花、代赭石、人參、甘草等中藥飲片由南京海源中藥飲片有限公司提供，并經南京海昌中藥集團有限公司劉遜碩士鑒定。乙腈 (色譜級)，純凈水，其余試劑均為分析級。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計 根據傳統的湯劑煎煮方法和前期預實驗結果，選用浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數作為考察因素，并確定各因素水平，以旋覆代赭湯中綠原酸、甘草酸和人參皂苷Rg1、Re、Rb1及湯劑浸出物得率為指標，采用L9(34)正交實驗表安排實驗，其因素水平見表1。

2.2 湯劑溶液制備 按旋覆湯處方稱取旋覆花9 g、甘草6 g、人參6 g、代赭石9 g、半夏9 g、干姜10 g、大棗4枚，于煎藥砂鍋中，按L9(34)正交實驗表所列條件進行煎煮，濾過，合并濾液，加水定容至2000 mL量瓶中，搖勻，即得湯劑溶液。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.3 各指標成分的定量測定

2.3.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為0.1%磷酸水溶液 (A)和乙腈溶液 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，5% ～10%B;10～28min，10% ～15%B;28～58 min，15% ～18%B;58～75 min，18% ～25%B;75～125 min，25% ～50%B);體積流量1.0 mL/min;檢測波長為203 nm和254 nm;柱溫35℃;進樣量10 μL，結果見圖1和圖2，綠原酸、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草酸銨色譜峰保留時間分別為21.1，81.9，82.4，101.7，110.3 min。

圖1 混和對照品HPLC圖譜(A.254 nm B.203 nm)Fig.1 HPLC in mixed standards(A.254 nm B.203 nm)

圖2 旋覆代赭湯的HPLC圖譜 (C.254 nm D.203 nm)Fig.2 HPLC in Xuanfu Daizhe Decoction samples(C.254 nm D.203 nm)

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質量的綠原酸、甘草酸銨、人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，加甲醇適量溶解，定容至10 mL量瓶中，配制成含綠原酸0.591 mg/mL、甘草酸銨0.221 mg/mL(折合甘草酸為 0.2165 mg/mL［10］)、人參皂苷Rg10.513、Re 0.515、Rb10.660 mg/mL的混標溶液，4℃存放備用。

2.3.3 標準曲線繪制 分別精密移取上述混標溶液適量，加甲醇溶解，稀釋制成不同濃度的混標溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄各標準品峰面積。以各標準品進樣量為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2，均顯示線性關系良好。

表2 5種標準對照品的線性回歸方程Tab.2 Linear equation of five analytes

2.3.4 供試品溶液制備及測定 精密移取2.2項下湯劑溶液100 mL，旋轉蒸發儀蒸去水溶液，殘渣用80%甲醇超聲提取30 min，提取液3000 r/min離心10 min，取上清液，80%甲醇定容至10 mL量瓶中，作為供試品溶液。0.45 μm微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積值，計算各指標成分質量分數，結果見表3。

表3 正交實驗結果Tab.3 Result of orthogonal design assay

2.3.5 精密度實驗 取對照品溶液，按樣品測定的方法，重復測定5次，記錄峰面積值，結果各指標成分的RSD值均小于5.0%，表明本法精密度良好。

2.3.6 重復性實驗 取同一批號的處方藥材樣品6份，按供試品溶液制備的方法操作，并進樣分析，計算各指標成分含量的RSD值，均小于5.0%，說明本方法重復性良好。

2.3.7 回收率實驗 取已知5種指標成分的旋覆代赭湯樣品溶液5份，分別準確加入適量混合對照品溶液 (含綠原酸0.591 mg/mL、人參皂苷Rg10.513 mg/mL、Re 0.515 mg/mL、Rb10.660 mg/mL、甘草酸銨0.221 mg/mL)，按制備供試品溶液的方法制備加樣回收供試品溶液，HPLC法測定各成分，計算得綠原酸、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、甘草酸平均回收率分別為97.60%、97.95%、98.42%、97.90%、97.31%，其RSD值均小于5.0%。

2.3.8 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別于0、2.5、5、7.5、10、24 h進樣6次，結果24 h內各指標成分峰面積的RSD值均小于5.0%，表明24 h供試品溶液穩定性良好。

2.4 正交實驗結果分析 由于本次實驗同時對旋覆湯的5個有效成分進行分析，故結合其浸出物得率，采用綜合加權評分法，5個成分的權重系數均為0.15，浸出物得率的權重系數為0.25，見表3。分別把6個成分項中最好的指標定為100分，其它各實驗項按下式評分:

對所得實驗結果進行直觀分析和方差分析，結果見表3和表4。從表3的結果可以看出，各因素的主次順序為D＞B＞C＞A，因素A的極差最小，故將此列作為方差分析的誤差列，由表4可知，因素B和D對實驗結果有顯著影響 (P＜0.01)，因素A和C對實驗結果均無顯著影響 (P＞0.05)，經過綜合分析，確定旋覆代赭湯最佳煎煮工藝為A2B3C1D3。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.5 最佳煎煮工藝驗證 取3份處方藥材，按照已確定的最佳煎煮工藝煎煮，測得浸出物平均得率為 (25.857±1.66)%，湯劑中綠原酸，人參皂苷 Rg1、Re、Rb1以及甘草酸的質量分數，結果見表5。

3 討論

旋覆代赭湯是中醫臨床治療胃氣受損、心下痞哽、噫氣不除等癥的常用湯劑，但因復方成分復雜，其煎煮方法的科學與否會直接影響到臨床療效，多指標優選中藥復方湯劑煎煮工藝，是提高中藥湯劑質量的重要手段，能更合理、更全面的評價整個煎煮過程［11-12］，故本研究通過正交實驗設計，采用多指標綜合評分，得到的旋覆代赭湯最佳煎煮方案為:處方藥材加水10倍量，浸泡15 min，煎煮3次，每次煎煮30 min，后合并濾液。經驗證，該煎煮方法穩定可行，能有效控制旋覆代赭湯的質量。

表5 最佳工藝驗證 (±s，n=3)Tab.5 Validation of best process(±s，n=3)

表5 最佳工藝驗證 (±s，n=3)Tab.5 Validation of best process(±s，n=3)

指標成分 平均質量分數/(mg·g－1)1.018±0.16人參皂苷Rg1 7.382±0.51人參皂苷Re 8.526±0.78人參皂苷Rb1 7.293±1.61甘草酸綠原酸8.096±1.02

本實驗采用雙波長同時測定旋覆代赭湯5種有效成分的方法，是經過多次試驗摸索確定的，所測各峰與其它峰有良好的分離度，并通過全面的方法學考察研究，結果證實該方法可以達到中藥湯劑中有效成分測定的要求，且準確、可靠。

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