靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo細胞增殖及凋亡的影響

梁曾恩妮， 易有金， 郭雨桐， 王仁才， 熊興耀*

(1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南長沙410128;2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128)

結腸癌是發生于結腸部位的常見消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第3位，近年來其發病率呈上升趨勢。5-氟尿嘧啶對消化系統癌療效較好，是治療結腸癌的常見藥物，屬于劑量依賴型藥物。因此療效增加的同時藥物副作用也隨之增加，這已成為治療中的難題，限制了化療藥物的臨床應用，降低了療效［1］。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性，其抗腫瘤作用備受關注［2-3］。研究證明中藥與化療藥物聯用不但可以減少藥物的不良反應，還可使每藥發揮最大療效［4-5］，使臨床效果達到最佳。但靈芝多糖與抗癌化療藥物聯合應用的研究很少［6］，尚未見靈芝多糖與化療藥物聯合作用于腫瘤細胞的報道。本實驗采用MTT法、聯合指數法、熒光染色和流式細胞術研究靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶在體外對人結腸癌LoVo細胞生長、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株LoVo由武漢微生物研究所提供。靈芝多糖由國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室提供。靈芝用熱水提取，脫蛋白、脫色素、葡聚糖凝膠Sephadex G-100和DEAE-纖維素層析柱分離純化，冷凍干燥得靈芝多糖粉。實驗前靈芝多糖和5-氟尿嘧啶用含10%血清的高糖DMEM培養液溶解，混勻，過濾除菌，－4℃保存。

胎牛血清 (FBS)、DMEM(高糖)培養基(美國Gibco公司);胰酶、碘化丙啶 (PI)(Beyotime公司);MTT(美國Sigma公司);5-氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業有限公司，批號:090807);二甲基亞砜 (DMSO)(北京Solarbio公司);6孔板和96孔板 (美國Conring公司)。

CO2培養箱2406-2(美國 Shellab公司);冷凍離心機CF16RXⅡ (日本日立公司);酶聯檢測儀mk3(美國 thermo公司);熒光倒置顯微鏡BX51(日本 Olympus公司);流式細胞儀 FC500(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 細胞培養及試劑配制 LoVo細胞株生長于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，貼壁生長，于37℃恒溫、5%CO2，飽和濕度的培養箱中培養。取對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化并吹打分散均勻后使用。

2.2 細胞增殖抑制率的測定 采用MTT法［7］進行。前期實驗測定了靈芝多糖 IC50值為2.33 mg/mL，后續實驗的靈芝多糖質量濃度梯度設計以此為基礎，5-氟尿嘧啶的劑量設置參照文獻 ［8］。將對數生長期密度為3×104個/mL的LoVo細胞接種于96孔培養板內，每孔接種100 μL。培養24 h后，吸棄上清液，每孔加200 μL藥液。實驗共分5組，分別為靈芝多糖組 (終質量濃度為0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)、5-氟尿嘧啶組 (終質量濃度為25、50、100 μg/mL)、聯用組 (靈芝多糖終濃度為0.313、0.625、1.25和2.5 mg/L，5-氟尿嘧啶終質量濃度為6.25、12.5、25和50 μg/mL，兩藥合用比例為1∶1方案)，另設對照組 (細胞、培養基和血清)和空白組 (培養基和血清)，每組5個復孔。分別培養24 h、48 h和72 h后，每孔加MTT(5 mg/L)20 μL，繼續培養4 h后，小心吸棄上清液，每孔加150 μL DMSO，輕輕震蕩10 min，用酶標儀在492 nm處測定光密度 (A)值。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率:腫瘤細胞生長抑制率 (inhibitory rate，IR)=(1－實驗組A492值/對照組A492值) ×100%。

2.3 藥物聯合作用評價 參照文獻 ［9］，采用Chou-Talalay聯合指數法分析靈芝多糖和5-氟尿嘧啶之間相互作用效果。已知OD值求出藥物作用效應 (Fraction affected，fa)即抑制率，根據中效方程式fa/fu=(D/Dm)m，兩邊取對數lg(fa/fu)=mlgD－mlgDm。其中:fa為藥物作用效應;fu=1－fa，D為藥物質量濃度;m為斜率;Dm為中效質量濃度，即達到50%效應時的藥物濃度。采用IC50計算軟件算出中效質量濃度Dm(即IC50)，再計算出單用及兩藥合用時在各種效應時所需藥物質量濃度fa/fu=(D/Dm)m，可計算出兩藥合用時在各種效應時的合用指數 (Combination index，CI)，CI=D1/DX1+D2/DX2+ αD1D2/DX1DX2，其中 D1、D2為兩藥合用時產生X效應時兩藥各自所需質量濃度，DX1、DX2為兩藥單獨使用時產生X效應時兩藥各自質量濃度。α為常數，當兩種藥物合相互排斥時為0，當兩種藥物相互非排斥時為1。靈芝多糖和5-氟尿嘧啶的相互作用為非排斥性，取α=1。CI＜1，協同;CI=1，相加;CI＞1，拮抗。

2.4 細胞凋亡和細胞周期的檢測 參照文獻［10］，6孔板中接種處于對數生長期的細胞，每孔1×106個細胞，放置于培養箱過夜。加入不同質量濃度的靈芝多糖培養24和48 h，同時設陰性對照組。胰酶消化細胞，生理鹽水洗滌3次后，棄上清，－4℃ 70%乙醇固定過夜。PBS洗滌3次，制成單細胞懸液，加入0.5 mL PI染色液 (50 mg/L PI，1 g/L檸檬酸鈉，10 g/L Triton X-100，1 mg/L RNase A)，4℃避光放置30 min，過400目篩網，流式細胞儀檢測，Modfit LT軟件分析結果。

2.5 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗。

3 結果

3.1 靈芝多糖和5-氟尿嘧啶對LoVo細胞的增殖作用

3.1.1 靈芝多糖、5-氟尿嘧啶單獨用藥抑制LoVo細胞增殖作用 由圖1可知，與對照組相比，靈芝多糖和5-氟尿嘧啶均對LoVo細胞顯示出了良好的殺傷效果 (P＜0.01)，并呈劑量和時間依賴性。以靈芝多糖質量濃度為5 mg/mL作用72 h抑制率最高，IC50為5.83 mg/mL。5-氟尿嘧啶質量濃度為100 μg/mL作用72 h抑制率最高，作用48 h、72 h的 IC50為 36.55 μg/mL、10.73 μg/mL。

3.1.2 靈芝多糖聯用5-氟尿嘧啶抑制LoVo細胞增殖作用 結果見表1。

圖1 靈芝多糖、5-氟尿嘧啶單用對LoVo細胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil alone on the proliferation of LoVo cells

表1 靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo的增殖抑制率(n=4)Tab.1 Inhibitory effect of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil on the proliferation of LoVo cells(n=4)

結果可知，靈芝多糖聯用5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞LoVo增殖抑制效應隨時間的延長而增強，但無劑量上依賴。兩藥聯用采用聯合指數法計算CI值，fa=0.86，即89%的LoVo細胞生長受抑制時，CI≈1，兩藥聯合效應相加;當fa＜0.86，即靈芝多糖質量濃度＜14.70 mg/mL，5-氟尿嘧啶質量濃度＜0.29 mg/mL時，CI＜1，兩藥聯合產生協同效應;當fa＞0.86時，CI＞1，兩藥合用效應拮抗。當抑制效應fa=0.50時，聯合用藥組 (5-氟尿嘧啶的質量濃度為0.86 μg/mL)，相對于5-氟尿嘧啶單獨應用 (5-氟尿嘧啶的質量濃度為0.01 mg/mL)并取得相同效應時，5-氟尿嘧啶的劑量減少了10.6倍 (見表2、圖2)。

3.2 靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo凋亡率的影響 流式細胞儀分析表明，5-氟尿嘧啶單獨用藥組和聯合用藥組作用LoVo細胞24 h后，可見明顯的亞G1峰，即凋亡峰，且隨作用時間延長，凋亡率升高，但無劑量依賴性 (見圖3)。聯合用藥24 h，1.25 mg/mL 靈芝多糖聯合 12.5 μg/mL 5-氟尿嘧啶的凋亡率最高 (14.42%)，高于5-氟尿嘧啶組 (11.37%);聯合用藥48 h，0.625 mg/mL靈芝多糖和6.25 μg/mL 5-氟尿嘧啶聯合用藥凋亡率最高 (28.92%)，高于5-氟尿嘧啶組(23.29%)。

表2 兩種抗癌藥單用及合用時m、Dm、rTab.2 m、Dm、r of Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil alone or combined

圖2 靈芝多糖和5-氟尿嘧啶合用對LoVo細胞的效應與合用指數曲線Fig.2 Curve of combination index and fraction affected after treatment with Ganoderma lucidum polysaccharide and 5-fluorouracil on LoVo cells

3.3 靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo細胞周期的影響 與對照組相比，5-氟尿嘧啶干預LoVo細胞24、48 h后，G0/G1期和G2/M期細胞比例下降，S期細胞比例明顯升高，并呈時間依賴性。兩藥聯用對LoVo細胞也具有細胞周期特異性，但合用濃度的不同對細胞周期阻滯作用不同。聯合處理組 (中、低劑量)和5-氟尿嘧啶組較對照組G0/G1期和G2/M期細胞比例下降，S期細胞比例明顯升高;聯合處理組 (高劑量)較對照組G2/M升高。這表明低質量濃度聯合用藥組可使LoVo細胞阻滯于S期，高質量濃度聯合用藥組使LoVo細胞阻滯于G2/M期和S期，并呈時間依賴性 (見表3)。

圖3 靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo細胞48 h后周期和凋亡率的影響Fig.3 Apoptosis rate and cell cycle of LoVo cells after 48 h treatment with 5-fluorouracil and Ganoderma lucidum polysaccharide

表3 靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對LoVo細胞周期和凋亡率的影響Tab.3 Apoptosis and cell cycle of LoVo cells after treatment with 5-fluorouracil and Ganoderma lucidum polysaccharide

4 討論

在腫瘤化療過程中，在殺傷腫瘤細胞的同時也會危害機體正常的組織和細胞，損傷人體器官，降低宿主免疫力，并伴隨一系列毒副反應，從而影響化療療效。臨床實踐證實，腫瘤患者在接受化療的同時使用適當的中藥，有助于減輕化療藥物的毒副作用，能增強化療藥物的療效。研究發現靈芝多糖是一種生物免疫調節劑，它通過激活免疫細胞，增強DNA多聚酶α的活性以及促進白細胞介素(IL)的分泌等途徑來實現其增強機體的免疫功能［11］，同時還能增強某些藥物的細胞毒性［3］。但靈芝多糖聯合其他化療藥物作用腫瘤細胞研究甚少，未見靈芝多糖聯合其他化療藥物作用于結腸癌細胞的報道。

本研究通過體外實驗顯示，靈芝多糖和5-氟尿嘧啶單獨應用對LoVo細胞的增殖均有抑制作用，并呈時間上和劑量上依賴性。靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶用藥的凋亡率呈時間依賴性，但無劑量依賴性，且不同時間點兩藥聯合產生最大的抑制率的靈芝多糖質量濃度是不同的。靈芝多糖 (0.625、1.25、2.5、5 mg/mL)和 5-氟尿嘧啶 (25、50、100 μg/mL)兩藥聯合應用可對LoVo細胞產生協同作用。流式細胞術顯示靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶作用LoVo細胞24 h后，細胞周期分布發生了明顯變化。高質量濃度兩藥聯用細胞周期滯留在S期和G2/M期，低質量濃度兩藥聯用滯留在S期，并呈時間依賴性。5-氟尿嘧啶可使LoVo細胞周期滯留在S期，與文獻報道一致［12］。

IC50的計算方法主要有 Logic［13］，Bliss［14］及直線回歸等多種計算方法，在數據處理過程中發現，不同的方法算出的IC50也有所不同。Logic等方法計算繁瑣、費時，采用直線回歸求IC50常常因為線性關系不好，結果偏差較大。且與其他方法相比，以Bliss算法為原理，利用現代高科技計算機技術，采用IC50計算軟件計算IC50求IC50較簡便、快捷，而且得到的值較為準確，故采用IC50計算軟件和聯合指數法相結合，處理靈芝多糖和5-氟尿嘧啶聯合對LoVo細胞相互作用的實驗數據。

PI(碘化丙啶)能夠與雙鏈DNA/RNA螺旋的大溝部位結合，它被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜。由于PI不能進入完整的活細胞膜和早期凋亡細胞的細胞膜，因此PI標記流式細胞術檢測是細胞晚期凋亡率。靈芝多糖和5-氟尿嘧啶聯用能誘導人結腸癌LoVo細胞凋亡，并有時間依賴性，但無劑量依賴性。用藥24、48 h后，聯合用藥組的凋亡率 (14.42%、28.92%)高于 5-氟尿嘧啶單獨用藥組(11.37%、23.29%)。

總之，靈芝多糖聯合5-氟尿嘧啶對人結腸癌LoVo細胞的增殖抑制有較好地協同增效作用，兩藥聯用對誘導LoVo細胞的凋亡也有一定程度的協同作用，阻滯細胞周期可能是兩藥聯合誘導細胞凋亡的機理之一。若在臨床上聯合應用靈芝多糖和5-氟尿嘧啶治療結腸癌，有可能既降低化療藥物的使用劑量減輕化療藥物對患者的毒副作用，同時又能提高療效，具有較好的臨床應用前景。由于兩藥互相作用機制不一樣，用量，給藥的順序還有待進一步研究;體內實驗結果與臨床觀察結果的相關率較高，還需進一步進行體內實驗探索。

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