黃連解毒湯及其不同配伍組方成分溶出變化研究

劉冬敏， 劉樹民， 祖金祥， 盧 芳， 荊 雷， 何 薇， 黃志桓

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

黃連解毒湯是清熱解毒方中的經典方劑，該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成。方中黃連和黃柏的主要有效成分為多種小檗堿型生物堿［1］，亦是本方的主要成分，文獻［2-4］表明二藥配伍可顯著增加生物堿的溶出。黃芩的主要成分為黃酮類［5-6］，梔子的主要成分為環烯醚萜類［7-8］。本實驗對黃連解毒湯及其可配伍組合的10個拆方的水煎劑及煎劑中的生物堿、黃酮類、環烯醚萜類進行了溶出變化的測定分析，并與原藥材中的含有量進行比較，研究了傳統水煎復方黃連解毒湯中有效成分生物堿、黃酮類、環烯醚萜類的溶出變化情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津);KQ-1007DB型數控超聲波清洗儀;上海良平儀器表有限公司-FA2004型電子天平(d:0.0001 g)。

1.2 試劑 乙腈 (色譜純，美國Fisher);甲醇(色譜純，美國DIKMA);娃哈哈純凈水(吉林市吉林經濟開發區磐石工業園);其他試劑為分析純。

1.3 試藥 黃連產自四川，黃柏產自四川，黃芩產自黑龍江，梔子產自江西，經黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院王連芝副研究員分別鑒別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch的干燥根莖，蕓香科植物黃皮樹Phellodendron amurense Rupr除去粗皮的干燥樹皮，唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實。黃連解毒湯樣品為將四味藥按配方比例［黃連-黃芩-黃柏-梔子(3∶2∶2∶3)］的自提水煎液干燥品，共7批。黃連解毒湯11個配伍組方樣品為按全方比例配伍自提水提物。

黃連堿對照品(上海融禾醫藥科技有限公司，批號為08109);梔子苷對照品(批號為110749-200613)，黃芩苷對照品(批號為110715-200514)，漢黃芩素對照品(批號為111514-200403)，鹽酸小檗堿對照品(批號為110713-200609)，鹽酸藥根堿對照品(批號為0733-200005)，鹽酸巴馬汀對照品(批號為110732-200506)，黃芩素對照品(批號為111588-200501)均由中國藥品生物制品檢定所提供;綠原酸對照品(SIGMA-ALORICH，批號為048KBB)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil(TM)-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm);流動相為甲醇-水(含 0.1%醋酸)，梯度洗脫(洗脫條件見表1);柱溫30℃;檢測波長254 nm;體積流量 1.0 mL/min;進樣量 10 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution method of mobile phase

2.2 樣品制備

2.2.1 供試品溶液的制備 1號煎劑(HLJD):600 g［黃連、黃芩、黃柏、梔子(3∶2∶2∶3)］浸泡2 h后，分別用8倍、6倍蒸餾水加熱回流1.5 h，四層紗布三層脫脂棉過濾，合并兩次濾液，60℃水浴揮干，電熱鼓風干燥箱40℃烘干，過120目篩制成干細粉。2號(LQ):600 g［黃連、黃芩(3 ∶2)］、3號(LB):600 g［黃連、黃柏(3 ∶2)］、4號(LZ):600 g［黃連、梔子(3 ∶3)］、5 號(QB):600 g［黃芩、黃柏(2∶2)］、6 號(QZ):600 g［黃芩、梔子(2 ∶3)］、7號(BZ):600 g［黃柏、梔子(2 ∶3)］、8 號(LQB):600 g［黃連、黃芩、黃柏(3 ∶2 ∶2)］、9 號(LQZ):600 g［黃連、黃芩、梔子(3 ∶2 ∶3)］、10 號(LBZ):600 g［黃連、黃柏、梔子(3 ∶2 ∶3)］、11 號(QBZ):600 g［黃芩、黃柏、梔子(2 ∶2 ∶3)］、12 號(L):600 g黃連(600 g)、13號(Q):600 g黃芩(600 g)、14號(B):600 g黃柏(600 g)、15號(Z):600 g梔子(600 g)煎煮方法和干燥方法同1號煎劑。

精密稱定1號煎劑生藥250 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容至25 mL，超聲溶解30 min，放冷，用甲醇補足減失的量配成10 mg/mL供試液，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾兩次，取續濾液，得1號供試液。2～15號煎劑生藥粉按比例同1號供試液分別配成 5、5、6、4、5、5、7、8、8、7、3、2、2、3 mg/mL 供試液體，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾2次，取續濾液，分別得到2號～15號供試液。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃連堿對照品、梔子苷對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩素對照品、鹽酸小檗堿對照品、鹽酸藥根堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、綠原酸對照品、黃芩素對照品適量，加甲醇分別制成質量濃度為 10 μg/mL的溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，得到9個對照品溶液，供分析用。

2.3 參照峰的選擇 將按照2.2項條件處理得到的供試品和9個對照品溶液，按2.1項條件進行色譜分析知，黃連解毒湯高效液相色譜圖譜中10、16、20、21、23、24、38、45、49 號峰的色譜峰依次為綠原酸、梔子苷、黃連堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，因黃連為方中君藥，且色譜圖譜中以鹽酸小檗堿峰面積最大且出峰穩定可靠，故選最強峰23號鹽酸小檗堿峰為參照峰。

2.4 共有峰的確定 通過7批固形物的指紋圖譜測定，比較其色譜圖，確定共有峰為50個(見圖1)。其中峰面積超過4%的色譜峰為16號，20號，23號，24號，38號，45號，49號峰。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取黃連解毒湯同一批次供試品溶液，連續進樣5次，測定高效液相圖譜，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行統計，結果表明各共有峰的相對保留時間和相對峰面積基本沒有明顯變化(RSD＜3%)，符合指紋圖譜的要求。

圖1 黃連解毒湯高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of HLJD

2.5.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h 進樣檢測，各主要色譜峰的相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積比值的RSD均小于3%，表明樣品在24 h內穩定。

2.5.3 重復性試驗 按前述方法制備供試品溶液5份，分別進樣檢測，各主要色譜峰的相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積比值的RSD均小于3%，表明方法的重復性良好。

2.6 黃連解毒湯10個配伍組方以及四味單味藥高效液相圖譜的建立 按黃連解毒湯指紋圖譜梯度洗脫2.1項條件，將2.2.1項制備的2～15號煎劑供試液分別進樣分析，得到10個配伍組方和4個單味藥高效液相圖譜(見圖2);并且對10個配伍組方和4個單味藥各峰的保留時間和峰面積進行統計。

圖2 黃連解毒湯10個配伍組方和4個單味藥高效液相圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ten combinations and four single herbs of HLJD

2.7 色譜峰歸屬 由復方、10個配伍組方結合4個單味藥高效液相譜圖分析結果知，黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、梔子苷、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素在15個組方中峰面積所占比例均超過4%，且黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀均屬于生物堿成分，可粗略代表方劑中總生物堿的量;梔子苷屬于環烯醚萜類成分，可粗略代表方劑中環烯醚萜的量;黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素均屬于黃酮類成分，可粗略代表方劑中總黃酮類成分量。從以上9個成分分別對黃連解毒湯和10個配伍組方的色譜峰進行歸屬分析，結果見表2～4。由9個標準品分析四味單味藥成分，可得黃連色譜峰中14號峰(L14)為黃連堿，15號峰(L15)為藥根堿，17號峰(L17)為小檗堿，18號峰(L18)為巴馬汀;黃芩色譜峰中5號峰(Q5)為黃芩苷，11號峰(Q11)為黃芩素，15號峰(Q15)為漢黃芩素;黃柏色譜峰中14號峰(B14)為小檗堿，15號峰(B15)為巴馬汀;梔子色譜峰9號峰(Z9)為綠原酸，梔子色譜峰中12號峰(Z12)為梔子苷。

表2 黃連解毒湯及其配伍組方中生物堿類色譜峰歸屬Tab.2 Chromatographic peaks attribution of alkaloids in HLJD and its different combinations

3 討論

3.1 色譜條件的確定 通過對樣品在190～400 nm的三維色譜圖和各對照品最大吸收波長的分析，選擇 4 個不同波長進行檢測，分別是 240［9］，280［10］，340［11］和 254［12］nm，再對 4 個波長下檢測的色譜圖進行比較，發現254 nm波長檢測的色譜圖基線較平，且能最大程度地反映黃連解毒湯中所含的3類組分的化學信息，故最后選擇254 nm作為指紋圖譜檢測波長。

表3 黃連解毒湯及其配伍組方中黃酮類色譜峰歸屬Tab.3 Chromatographic peaks attribution of flavonoids in HLJD and its different combinations

表4 黃連解毒湯及其配伍組方中環烯醚萜類色譜峰歸屬Tab.4 Chromatographic peaks attribution of iridoids in HLJD and its different combinations

實驗中首先考察了不同系統的流動相，包括乙腈-水，乙腈-水(含 0.1% 磷酸)，乙腈-水(含 0.1%醋酸)，甲醇-水，甲醇-水(含 0.1% 醋酸)，結果表明以甲醇-水(含0.1%醋酸)效果最好，本實驗所采用的色譜條件能將各單味藥主要成分在170 min內洗脫，且各類主要成分能得到良好的分離，從而保證最大限度體現四味藥的特征。

3.2 生藥水煎液中主要成分溶出變化分析 按2.2.1項方法煎煮得到的各配伍組方煎劑進行HPLC檢測后，以單味黃連、黃芩、黃柏、梔子水煎液所得生物堿類、黃酮類、環烯醚萜類的色譜峰面積作為基準，分析黃連解毒湯和各拆方中上述三類物質溶出變化情況。結果可見，生物堿的溶出量與單味生藥比較明顯下降，但黃酮類和環烯醚萜類成分溶出量明顯增加，且由于配伍的不同，煎液中各成分的相互影響不同，從而使單個化學成分和某類化學成分總量減少或增加也不盡相同。(1)生物堿類:LB配伍生物堿溶出增加為單味藥的101.0%，剩余配伍組合均減少;其中四味藥配伍損失最大為原來的43.3%;其次LQB配伍損失為原來的57%;LBZ配伍黃連堿、藥根堿、小檗堿均少量損失，巴馬汀少量增加，生物堿損失為原來的88.7%;LQZ配伍黃連堿、藥根堿、小檗堿均大量損失，巴馬汀少量增加;BZ小檗堿少量減少，巴馬汀少量增加，故推測黃芩與黃連、黃柏配伍產生沉淀使生物堿溶出降低。(2)環烯醚萜類:LZ、BZ、LBZ配伍綠原酸、梔子苷等環烯醚萜類分別增加為原來的111.5%、124.5%、137.2%;QZ、QBZ、LQZ 配伍分別降低為 77.3%、79.2%、99.4%;LZ配伍綠原酸少量減少，梔子苷明顯增加為原來的137.4%，故推測黃芩與梔子配伍使環烯醚萜類成分溶出降低，四藥配伍溶出增加為112.6%。(3)黃酮類:LQ、QB、QZ、LQB、LQZ 配伍使黃酮類溶出分別增加為原來的 127.9%、144.9%、139.6%、159.6%、136.1%;QBZ 配伍使黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分溶出明顯減低為原來的25.3%;但四藥配伍可以增加其的溶出為480.7%。

4 小結

目前對黃連解毒湯及其配伍拆方的成分研究國內外文獻均較多，但均較不全面，本實驗對黃連解毒湯可配伍組合的所有拆方進行了研究，得出了較為全面的分析結果。從本研究可知，雖然復方中生物堿的量明顯少于單味生藥，但臨床上復方的療效明顯優于單味生藥，說明多個生物堿以合理的比例同時作用于機體時產生的藥效要優于單個生物堿的作用;而且除了生物堿之外其它兩類主要成分溶出均有所增加，說明經過了幾百年乃至上千年實踐證明的傳統復方黃連解毒湯其四藥配伍在臨床上產生的藥效優于單味藥及其它配伍組方的藥效。本實驗不僅為黃連解毒湯成分分析研究提供依據，并且為黃連解毒湯體內成分研究打下了良好的基礎。

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