HPLC-DAD-MS/MS用于養血清腦顆粒蒽醌類成分分析

郝曉霞， 靳元鵬， 軋 霽， 張蘭蘭， 周水平， 郭治昕*

(1.天津中醫藥大學，天津300193;2.天津天士力制藥股份有限公司，天津300410)

養血清腦顆粒是由天津天士力制藥股份有限公司生產的一種復方中藥，以川芎、當歸為君藥，由十一味中藥采用現代化制劑工藝精制而成。養血清腦顆粒可以改善軟腦膜微循環，增加腦血流量，緩解血管痙攣與止痛，具有養血平肝、活血通絡之功效［1］。決明子是養血清腦顆粒中的重要藥味之一［2］，根據文獻報道，決明子中蒽醌類成分具有降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化等功效［3-5］。我們對養血清腦顆粒中的蒽醌類成分進行富集，并對目標部位的化學成分進行分析與研究。以蒽醌部位為研究對象，與養血清腦顆粒整體為研究對象相比，可以更好的富集其中的起效成分，不僅為養血清腦顆粒治療偏頭痛與高血壓提供了物質基礎，而且為其質量控制提供了支持。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀及Agilent 1200 HPLC-6310 ION Trap Mass液相色譜-質譜聯用系統(美國Agilent公司);Milli-Q超純水系統(法國 Millipore公司);乙腈(色譜級，美國Merck公司)。

蘆薈大黃素(批號:110795-200806)、大黃素(批號:110756-200110)、大 黃 酚 (批 號:110796-200615)、橙黃決明素(批號:111900-201001)對照品，均購自中國藥品生物制品檢定所。養血清腦顆粒浸膏由天津天士力制藥股份有限公司提供(浸膏批號:20100907)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

液相條件:色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，Gemini 5 μm);流動相 A 為乙腈，流動相B為0.5%的甲酸-水，梯度洗脫見表1。體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為 254 nm，190 ～500 nm全波長掃描，柱溫為30℃，進樣量10 μL。

質譜條件:檢測模式為電噴霧離子化(ESI)方式，檢測離子為正、負離子，掃描范圍100～1000 m/z，干燥氣的流量為8 L/min，干燥氣的溫度為350℃，霧化氣的壓力為241 kPa。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Procedure of gradient elution of mobile phase

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取上述對照品(橙黃決明素5.1 mg，蘆薈大黃素 2.85 mg，大黃素5.01 mg，大黃酚 4.18 mg)置于 100 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液既得對照品溶液［6］。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取未加入輔料的養血清腦顆粒浸膏100 g，用20%的乙醇溶解，以D101大孔樹脂柱層析分離，用20%乙醇(5 BV)、95%乙醇(5 BV)分別洗脫，收集95%乙醇洗脫液，將目標物富集。將95%乙醇洗脫液濃縮至糊狀，用30%乙醇溶液溶解，以100～200目的聚酰胺柱層析分離，30%乙醇(5 BV)、95%乙醇(5 BV)分別洗脫。收集95%乙醇洗脫液即為目標蒽醌部位。

2.4 HPLC-DAD-MS/MS特征峰歸屬 通過液質聯用技術，結合供試品與標準品的比較可以完成對物質的定性分析［7-9］。本實驗以養血清腦顆粒為研究對象，對其中的蒽醌成分進行分析，結合質譜碎片信息及混合標準品的成分比較，對特征峰進行了歸屬指認。供試品與對照品比較圖譜見圖1，供試品溶液的液質聯用圖譜見圖2，特征峰歸屬指認結果見表2，部分蒽醌類物質的結構式見表3。

圖1 供試品(A)與對照品(B)HPLC比較圖譜1.橙黃決明素 2.蘆薈大黃素 3.大黃素 4.大黃酚Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)and mixed standard(B)1.aurantio-obtusin 2.aloeemodin 3.emodin 4.chrysophanol

圖2 養血清腦顆粒蒽醌部位LC-MS/MS聯用圖譜Fig.2 LC-MS/MS chromatograms of anthraquinones in Yangxue Qingnao GranuleA.ESI(+MS)B.ESI(-MS)C.ESI(+MSn)D.ESI(-MSn)E.HPLC-UV

表2 養血清腦顆粒中蒽醌類成分特征峰歸屬Tab.2 Results of LC-MS/MS analysis of anthraquinones in Yangxue Qingnao Granule

色譜峰 1，通過 m/z 902.8［M+H］+及 939.4［M+Cl］－共同判斷該物質分子量為902，結合文獻報道［10］及藥味歸屬，判斷該物質可能為決明子藥味中的大黃酚-四吡喃葡萄糖苷(chrysophanol-tetra-β-D-glucopyranoside)。色譜峰2，通過 m/z 331.0［M+H］+可推知該化合物的分子量為330，兩個碎片離子峰 315.6 ［M-CH3］+及 297.6［M-CH3-H2O］+可能通過如圖3所示途徑分裂而來。初步推測其可能為橙黃決明素(aurantio-obtusin)或 3-甲基-1，2，8-三羥基-6，7-二甲氧基蒽醌(1，2，8-trihydroxy-6，7-dimethoxy-3-methylanthraquinone)［2］，這兩種成分為同分異構體，難以通過質譜數據進行鑒別，而在相同的色譜條件下，橙黃決明素(aurantio-obtusin)標準品與供試品溶液中該物質保留時間相同，最終判斷該物質可能為決明子藥味中的橙黃決明素(aurantio-obtusin)［11］。色譜峰 5，通過 m/z 359.7 ［M+H］+推測它的分子量為358，而其他質譜碎片離子峰325.8［M-CH3-H2O］+、310.6［M-2CH3-H2O］+的結構推導如圖4。結合文獻報道［10］及藥味歸屬，該物質可能為決明子中的 3-甲基-2-羥基-1，6，7，8-四甲氧基蒽醌 (2-hydroxy-1，6，7，8-tetramethoxy-3-methylanthraquinone)。色譜峰6，通過m/z367.4［M+Na］+推測其分子量為344，307.1［M-2H2O］+可能為3-甲基-2，8-二羥基-1，6，7-三甲氧基蒽醌(2，8-dihydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methyl anthraquinone)脫掉兩分子水所得，結合文獻報道及藥味歸屬，推測其可能為 3-甲基-2，8-二羥基-1，6，7-三甲氧基蒽醌(2，8-dihydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)［2］。蘆薈大黃素 (aloeemodin)、大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)［13］質譜碎片離子峰分析如表2，且供試品與混合標準品溶液在相同的色譜條件下對應物質保留時間一致，進一步驗證了結構推測的準確性。

表3 部分蒽醌類物質的化學結構式Tab.3 Chemical structures of anthraquinones in Yangxue Qingnao Granule

2.5 特征成分的定量測定 已鑒定成分中，目前有標準品的物質為橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素及大黃酚，但是在目前的色譜條件下，大黃酸及大黃酚達不到定量測定分離度的要求，因此對已鑒定成分中的橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素3個物質定量測定。

2.5.1 線性關系考察 吸取適量2.2項的混合標準品溶液，以峰面積(A)為縱坐標，進樣體積(μL)為橫坐標進行線性回歸分析。線性回歸方程:橙黃決明素 Y=21.117X+1.4833，r2=0.9998，線性范圍為0.05 ～ 0.5 μg;蘆薈大黃素 Y=113.45X+9.6952，r2=0.9998，線性范圍為 0.03 ～ 0.3 μg;大黃素 Y=128.77X+7.5976，r2=0.9999，線性范圍為 0.05 ～0.5 μg。結果表明，橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素在一定的線性范圍內均有良好的線性。

圖3 化合物2(橙黃決明素)的主要碎裂途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of aurantio-obtusin

圖4 化合物5(3-甲基-2-羥基-1，6，7，8-四甲氧基蒽醌)的主要碎裂途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of 3-methyl-2-hydroxyl-1，6，7，8-tetramethoxy-anthraquinone

2.5.2 樣品測定 精密稱取蒽醌部位720 mg，置于25 mL的量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，進樣10 μL。以外標法計算目標蒽醌部位中的橙黃決明素、蘆薈大黃素及大黃素的量，結果顯示3種蒽醌的質量分數分別為:橙黃決明素15.76 mg/g，蘆薈大黃素 0.40 mg/g，大黃素 1.37 mg/g。

2.5.3 加樣回收率 精密稱取蒽醌部位360 mg，分別加入相應量的對照品貯備液，測定回收率，平行6份。計算加樣回收率，橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素的加樣回收率分別為 98.6%，99.2%，102.5%，RSD 分別為 3.1%，2.6%，4.2%。

3 討論

3.1 蒽醌部位制備方法的選擇 養血清腦顆粒由十一味中藥組方而成，成分復雜，而蒽醌類成分為養血中藥決明子的主要藥效成分。郝延軍等［12］以決明子為研究對象，通過不同吸附樹脂的比較，最終發現聚酰胺對決明子中的蒽醌物質富集效果最好，這種分離方法同時可以避免有毒有害有機試劑(如三氯甲烷等)的使用。養血清腦中蒽醌類成分極性較小，本實驗先通過D101大孔樹脂進行初步富集，除去大極性的干擾物質，而可能的藥效成分則進一步通過聚酰胺柱層析得到，兩種填料的結合使用可以更好的減少大極性物質的干擾，更加有效的富集蒽醌部位。

3.2 液相色譜條件的優化 選用了3根不同廠家的色譜柱進行實驗，比較分離度、峰形與柱效，最終確定為Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，Gemini 5 μm)液相色譜柱。考察了不同的流動相系統，最終確定以乙腈－0.5%甲酸為流動相較為適宜。以獲得最多的峰信息為基準考察，通過DAD選擇最佳吸收波長，最終確定蒽醌部位最佳吸收波長為254 nm。

HPLC-DAD-MS/MS分析技術廣泛應用于中藥復方制劑分析，結合分子量與碎片離子的雙重信息，可以對復方中的化學成分進行快速準確的鑒定。這種分析方法準確性較高，對某些同分異構體也可以得到很好的分析。本實驗首先通過有效的分離手段把養血清腦顆粒中的目標蒽醌進行富集，然后對此目標部位進行分析，最終確定了養血清腦顆粒中的8個蒽醌類特征成分。

3.3 部分特征峰的指認 由HPLC-MS數據及文獻報道［10］，初步推測1號峰可能為大黃酚-四吡喃葡萄糖苷。實驗中由于標準品的缺失，該特征峰的鑒定準確性有待于進一步驗證。

決明子具有較好的降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老等療效［13］，是養血清腦顆粒中非常重要的一味佐藥。其中蒽醌類成分是決明子主要的藥效成分［13］，因而深入研究養血清腦顆粒中的蒽醌類成分對養血清腦顆粒的質量控制及藥理藥效研究均具有重大意義。本實驗通過富集、分析養血清腦顆粒中的蒽醌類成分，推測養血清腦顆粒可能的藥效成分，為進一步的藥理實驗提供物質基礎。養血清腦顆粒中的蒽醌類及其他成分分析、對養血清腦顆粒治療高血壓與偏頭痛的研究也正在開展中，深入工作將會在后續文章中報道。

［1］高 鈞，孫玉俠，李 偉，等.HPLC法測定養血清腦顆粒中馬兜鈴酸 A［J］.中草藥，2005，36(6):851-852.

［2］李文博，韓建平，高 鈞，等.養血清腦顆粒的高效液相色譜指紋圖譜研究［J］.分析化學研究簡報，2011，39(3):387-391.

［3］郭 威，王少云.決明子鑒別及其主要有效成分含量測定的研究［D］.山東大學，2008.

［4］張加雄，萬 麗，胡軼娟，等.決明子降血脂有效部位的研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17(6):904-905.

［5］張 毅，黃小平，翁代群，等.HPLC測定不同產地決明子中蒽醌類成分［J］.中國中藥雜志，2008，33(23):2797-2798.

［6］張依倩，王 玉，黃芝娟，等.基于HPLC-DAD-MS的道地產區大黃藥材質量評價研究［J］.藥物評價研究，2011，34(3):179-183.

［7］許重遠，陳振德，張 焜，等.HPLC-MS-MS分析復方茵陳黃連湯中抗 HBV活性部位主要成分［J］.中藥材，2008，31(12):1839-1840.

［8］孫 慧，朱 超，章弘揚，等.大黃及其炮制品的液質聯用分析及物質基礎比較［J］.中成藥，2009，31(3):420-424.

［9］李文蘭，代歧昌，季宇彬，等.HPLC-ESI/MS分析八珍湯化學成分及來源［J］.中國藥學雜志，2009，44(21):1622-1626.

［10］張開慶，謝 亞，梁 勇.高效液相色譜-電噴霧電離質譜聯用研究決明子提取物中的化學成分［J］.華南師范大學學報:自然科學版，2008，5(2):88-94.

［11］胡軼娟，朱 軍，萬 麗.決明子HPLC指紋圖譜研究［J］.中國中醫藥科技，2008，15(5):365-367.

［12］郝延軍，趙余慶.決明子活性成分及總蒽醌提取工藝研究［D］.遼寧中醫學院，2001.

［13］劉 斌，鞏鴻霞，肖學鳳，等.決明子化學成分及藥理作用研究進展［J］.藥物評價研究，2010，33(4):312-315.