優(yōu)選不同溶劑對永思小檗中鹽酸小檗堿提取工藝

王緒英，左經(jīng)會，林長松，向 紅

(六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系，貴州六盤水 553004)

永思小檗(Berberis tsieniiYing)是小檗屬植物，是貴州特有藥用植物及貴州藥用新資源，據(jù)報道永思小檗僅分布于盤縣［1］，本研究發(fā)現(xiàn)其除分布于貴州西部的盤縣(八大山)外，還分布于水城(紙廠)、鐘山區(qū)(梅花山、韭菜坪)、威寧等地，生于山谷灌叢中，海拔高度為1800～2700m。其根和根皮入藥，主治濕熱痢疾，腸炎，黃疸，目赤紅腫，咽痛［2］。其有效成分為鹽酸小檗堿，廣泛用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等，對肺結(jié)核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道、婦科及外科感染也有一定的療效，近年來還發(fā)現(xiàn)它有抗心律失常的作用，服用后無明顯副作用［3］。關(guān)于鹽酸小檗堿的提取工藝在黃連、十大功勞、黃柏等作原料的研究較多，但由于黃柏等生長周期較慢，且藥用部位局限性較大(只能用皮作為提取原料)，逐漸轉(zhuǎn)向由三顆針做原料。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)在三顆針的有些種類中，可以用其根、莖或根皮、莖皮做原料，這樣就擴(kuò)大了用藥部位。其主要生產(chǎn)方法有水煎煮、酸水提取、乙醇提取、酸醇提取等［4］，陳月圓等［5］以小檗堿為指標(biāo)，對黃柏用水，乙醇，酸水3種提取溶劑提取發(fā)現(xiàn)乙醇作為提取溶劑明顯優(yōu)于其他溶劑。岑志芳等［6］研究發(fā)現(xiàn)超聲提取可提高黃柏中鹽酸小檗堿的提出率，縮短提取時間。同樣條件下，與浸漬法提取比較提高近l倍。王志華等［7］以鹽酸小檗堿的含量為指標(biāo)，水提稍差于醇提;以浸膏得率為指標(biāo)，醇提稍差于水提。乙醇和水都是極性溶劑，甲醇屬強(qiáng)極性溶劑，可提取出其中的鹽酸小檗堿，在甲醇中加入鹽酸，能把藥材中的小檗堿酸化為鹽酸小檗堿，根據(jù)相似相溶原理而被提出［8］。

永思小檗僅分布于貴州西部，關(guān)于永思小檗的研究，國內(nèi)僅見于其乙醇提取法的正交設(shè)計研究［9］，本研究以永思小檗為材料，鹽酸小檗堿得率為指標(biāo)，選擇以水、乙醇、鹽酸甲醇為提取溶劑，通過超聲波提取，用正交試驗設(shè)計考察超聲時間，超聲溫度、超聲體積等因素對鹽酸小檗堿得率的影響，優(yōu)選出永思小檗中鹽酸小檗堿不同溶劑的最佳超聲提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 鹽酸小檗堿對照品由貴州迪大科技有限公司提供，永思小檗產(chǎn)于貴州省鐘山區(qū)梅花山，實驗前將永思小檗根加工成粗粉，50℃烘24 h，置干燥器備用。甲醇、乙醇、鹽酸為國產(chǎn)分析純，水為重蒸水。

1.1.2 試驗儀器 JH－722型可見分光光度計(上海箐華科技儀器有限公司)、METTER.AE240型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)、BGZ型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司)、超聲波提取儀(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)、DFT－200型高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取置五氧化二磷真空干燥器干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品4.0 mg，用水溶解并移置100 mL容量瓶中定容，搖勻，即得濃度為40 μg/mL的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，備用。精密吸取鹽酸小檗堿儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，同時蒸餾水作空白，分別測出吸光度(345 nm波長處有最大光吸收)，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品含量的測定:

精密稱取藥材粉末，裝入具塞三角燒瓶中，超聲提取，合并濾液，濃縮，置100 mL容量瓶，加水定容，搖勻，即得供試液。分別精密吸取供試液1.0 mL，測定鹽酸小檗堿含量，計算其得率。

1.4 正交試驗設(shè)計

鹽酸小檗堿由兩個異喹啉環(huán)稠合而成［10］，微溶于冷水，易溶于沸水，幾乎不溶于冷乙醇、氯仿和乙醚［11］，在熱水或熱乙醇中溶解度比較大［12］，由以上性質(zhì)故選擇以水，乙醇，鹽酸甲醇作為提取溶劑進(jìn)行正交實驗。

1.4.1 乙醇的正交實驗設(shè)計 首先選擇對提取有影響的因素進(jìn)行單因素實驗，根據(jù)實驗結(jié)果選擇正交試驗的因素，同時選擇合適的水平，設(shè)計正交試驗方案。根據(jù)影響乙醇提取的主要因素，選擇乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、超生溫度(C)、乙醇體積(D)作為考察因素，每個因素取3個水平(表1)。

表1 正交實驗方案(乙醇)Table 1 The factor and level of orthogonal experiments(ethanol)

1.4.2 水的正交實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇超聲時間(A)、超生溫度(B)、體積(C)作為考察因素，每個因素取3個水平(表2)。

1.4.3 鹽酸甲醇的正交實驗設(shè)計 根據(jù)對提取有影響的單因素實驗結(jié)果，選擇對選擇超聲時間(A)、超生溫度(B)、體積(C)作為考察因素，每個因素取3個水平(表3)。

表2 正交實驗方案(水)Table 2 The factor and level of orthogonal experiments(water)

表3 正交實驗方案(鹽酸甲醇)Table 3 The factor and level of orthogonal experiments(hydrochloric acid－methyl alcohol)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線:按方法項下標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得鹽酸小檗堿濃度C與吸光度A的回歸方程:C=0.1031A+0.0033，r=0.9994。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在 1.6 ～9.6μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

穩(wěn)定性試驗:取供試液室溫放置 0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 后分別測定吸光度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.23%，說明供試液在24 h內(nèi)基本保持不變。

精密度試驗:分別精密吸取供試液1.0 mL，平行操作測定5次吸光度，結(jié)果RSD為1.62%。

2.2 正交試驗

2.2.1 乙醇的正交實驗結(jié)果 取永思小檗粗粉1 g，在平行操作下，按表1［L9(34)］進(jìn)行正交實驗，合并提取液濃縮至相同體積，備用。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果見表4和表5:

從均值分析，A因素第一個水平是最優(yōu)水平，因素B的第三個水平是最優(yōu)水平，因素C的第三個水平是最優(yōu)水平，因素D的第一個水平是最優(yōu)水平。各因素的最佳水平A1B3C3D1，即45%乙醇以1:150的固液比，60℃下超聲提取40 min。由極差分析，因素C的變化對鹽酸小檗堿得率的影響最大，因素A次之，因素D的影響最小，即影響鹽酸小檗堿得率的因素主次依次排序為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量。各個因素對鹽酸小檗堿得率的影響都不顯著。

表4 正交實驗結(jié)果(乙醇)Table 4 The results of orthogonal experiments(ethanol)

鹽酸小檗堿得率(mg)The content of berberine hydrochloride實驗7 65% 20 60 1:因素Factor酒精濃度A(%)Concentration時間B(min)Time溫度C(℃)Temperature固液比D Solid liquid ratio 200 10.3752實驗 8 65% 30 40 1:250 9.7463實驗 9 65% 40 50 1:150 10.8600均值 1 10.958 10.461 10.190 10.865均值 2 10.700 10.635 10.764 10.540均值 3 10.327 10.889 11.032 10.580極差0.631 0.428 0.842 0.325

表5 方差分析結(jié)果(乙醇)Table 5 Variance analysis result(ethanol)

2.2.2 水的正交實驗結(jié)果 取永思小檗粗粉0.5 g，在平行操作下，按表2［L9(34)］進(jìn)行正交實驗，以鹽酸小檗堿的得率為考察指標(biāo)，合并提取液濃縮至相同體積，備用。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果見表6和表7:

從均值分析，A因素第三個水平是最優(yōu)水平，因素B的第三個水平是最優(yōu)水平，因素C的第二個水平是最優(yōu)水平。各因素的最佳水平為A3B3C2，即1:150的固液比，70℃下超聲提取50 min。由極差分析，因素B的變化對鹽酸小檗堿得率的影響最大，因素A次之，因素C的影響最小，即影響鹽酸小檗堿得率的因素主次依次排序為提取溫度＞提取時間＞水用量。各個因素對鹽酸小檗堿得率的影響都不顯著。

表7 方差分析結(jié)果(水)Table 7 Variance analysis result(water)

2.2.3 鹽酸甲醇的正交實驗結(jié)果 取永思小檗粗粉0.5 g，在平行操作下，按表3［L9(34)］正交實驗，以鹽酸小檗堿的得率為考察指標(biāo)，合并提取液濃縮至相同體積，備用。對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果見表8和表9:

從均值分析，A因素第三個水平是最優(yōu)水平，因素B的第一個水平是最優(yōu)水平，因素C的第二個水平是最優(yōu)水平。各因素的最佳水平為A3B1C2，即1:150的固液比，30℃下超聲提取50 min。由極差分析，因素A的變化對鹽酸小檗堿得率的影響最大，因素C次之，因素B的影響最小，即影響鹽酸小檗堿得率的因素主次依次排序為提取時間＞鹽酸甲醇用量＞提取溫度。由方差分析，超聲提取時間對鹽酸小檗堿得率的影響顯著。

表8 正交設(shè)計結(jié)果(鹽酸甲醇)Table 8 The results of orthogonal experiments(hydrochloric acid－methyl alcohol)

表9 方差分析結(jié)果(鹽酸甲醇)Table 9 Variance analysis result(hydrochloric acid－methyl alcohol)

2.3 最佳工藝驗證實驗

為考察乙醇、水、鹽酸甲醇三種溶劑對永思小檗中鹽酸小檗堿的優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性，取永思小檗9份，每份0.5 g，按優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行提取(三個平行)，測定鹽酸小檗堿得率，結(jié)果見表10:

表10 鹽酸小檗堿的提取率Table 10 The extraction rate of berberine hydrochloride

3 結(jié)論與討論

1)永思小檗中鹽酸小檗堿最佳超聲提取工藝為:以150倍45%乙醇作溶媒，60℃超聲，時間為40 min，影響鹽酸小檗堿含量的因素主次依次排序為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量;以150倍水作溶媒，70℃下超聲提取50 min，影響鹽酸小檗堿得率的因素主次依次排序為提取溫度＞提取時間＞水用量，各個因素對鹽酸小檗堿得率的影響都不顯著;以150倍鹽酸甲醇作溶媒，30℃下超聲提取50 min，影響鹽酸小檗堿得率的因素主次依次排序為提取時間＞鹽酸甲醇用量＞提取溫度。超聲提取時間對鹽酸小檗堿得率的影響顯著。

2)從三種溶劑的最佳提取工藝可以看出，都是以150倍的固液比超聲40或50 min，超聲溫度與溶劑沸點的大小相一致，溶劑的沸點越低，超聲溫度越低，分別為甲醇30℃，乙醇60℃，水70℃。從鹽酸小檗堿的得率可知，水提取法最低，乙醇稍高，鹽酸甲醇最高，這是由于鹽酸小檗堿的極性比較強(qiáng)，根據(jù)相似相溶原理可以被提取出來，極性越高，越容易被提取出來。

3)從三種溶劑提取的鹽酸小檗堿的得率來看，用鹽酸甲醇作溶劑時鹽酸小檗堿的得率最高，這與陳月圓等對黃柏用水，乙醇，酸水3種提取溶劑提取發(fā)現(xiàn)，乙醇作為提取溶劑明顯優(yōu)于其他溶劑的研究不一致，這可能與黃柏中含有大量的粘液質(zhì)有關(guān)，也可能是用鹽酸甲醇提取時有些極性大的雜質(zhì)也溶解在溶劑中，造成結(jié)果偏高，這部分工作正在進(jìn)行當(dāng)中。

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