HPLC法定量測定原乳中青霉素鉀酶解產(chǎn)物的研究

高 頎，鮑曉瑾，倪煒華

（嘉興市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，浙江 嘉興 314050）

0 引 言

目前市場上出現(xiàn)一種抗生素分解劑，其成分為β-內(nèi)酰胺酶，可分解乳中殘留β-內(nèi)酰胺類抗生素，致使原本殘留的超標(biāo)抗生素?zé)o法檢出，使“有抗奶”變成“無抗奶”進(jìn)入市場。β-內(nèi)酰胺酶以其水解對象可分為青霉素酶、頭孢菌素酶等。其中最為常用的青霉素酶能裂解乳中青霉素使其降解形成青霉噻唑酸，通過對青霉噻唑酸的測定，就可證實(shí)原料乳中青霉素以及β-內(nèi)酰胺酶的存在。

對于青霉噻唑酸的測定，傳統(tǒng)方法有碘量法、pH計(jì)法、微生物法、HPLC法等，但這些方法各有其局限性。其中碘量法對條件要求較嚴(yán)格，極易因見光而造成誤差[1]；pH計(jì)法[2]可能受其他陽離子的干擾；微生物法[3]可以定性定量地檢測乳中的β-內(nèi)酰胺酶，但耗時長，操作復(fù)雜，容易造成污染而導(dǎo)致誤差；HPLC法目前僅限于對青霉噻唑酸作為副產(chǎn)物來定性。本文將利用HPLC法對青霉噻唑酸進(jìn)行定量測定，為探究原料乳中青霉素以及β-內(nèi)酰胺酶的存在及其含量做技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：無水乙醇（分析純，上海國藥）、磷酸二氫鈉（分析純，上海國藥）、甲醇（色譜純，天地）、青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品（98.0%，Wako）、青霉素酶（Tokyo Chemical Industry Co.Ltd.）、青霉噻唑酸鉀（自制）。

儀器：電子分析天平（德國賽多利斯）、高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、高效液相色譜儀（Agilent 1100）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青霉噻唑酸鉀標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

青霉素鉀在酶的存在或堿性條件下均會生成等量的青霉噻唑酸鉀[4-10]，因此通過HPLC法對照青霉素鉀在堿性條件與酶作用下的產(chǎn)物，判斷是否為同一種物質(zhì)即青霉噻唑酸鉀，可用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。方法：配制相同濃度的青霉素鉀溶液，一份加入青霉素酶1mL，室溫下水解2h；另一份加入氫氧化鉀（KOH），調(diào)整pH值為12，室溫下水解2h，最后用HPLC進(jìn)行測定。

1.2.2 HPLC法對青霉噻唑酸鉀檢測方法研究

牛乳去脂肪、去蛋白質(zhì)后，青霉噻唑酸鉀可被提取，經(jīng)高效液相色譜檢測其含量。具體操作：稱取30 mL樣品，于100 mL離心管中離心10 min（4℃，10 000 r/min），小心去除脂肪層，準(zhǔn)確吸取10 mL脫脂牛乳于100 mL離心管，加入10 mL無水乙醇，離心10 min（4℃，10000r/min），取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜待測。

液相條件：

色譜柱為 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；

流動相為甲醇∶磷酸二氫鈉（18g/L pH=4.5）=1∶1；

紫外檢測器波長為230nm；流速為1mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性及標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

按1.2.2色譜條件，對青霉素鉀、青霉素酶、青霉噻唑酸鉀進(jìn)行定性研究，觀察3種物質(zhì)出峰時間是否互相干擾。將濃度100mg/L的青霉噻唑酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至 2，6，10，20，60mg/L，用峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 回收率與精密度試驗(yàn)

分別在3份30mL牛乳樣品中加入青霉噻唑酸鉀0.5，1，2mg，按1.2.2方法提取牛乳中青霉噻唑酸鉀，每一水平作3次平行，以峰面積定量計(jì)算方法回收率，同一水平計(jì)算精密度。

1.2.5 方法檢出限測定

將含青霉噻唑酸鉀濃度1mg/L的3份不同牛乳樣品，按1.2.2方法進(jìn)行提取檢測，同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，以信噪比=3計(jì)算該方法檢出限濃度。

1.2.6 實(shí)際樣品檢測試驗(yàn)

從不同奶站抽取6份樣品進(jìn)行雙試樣檢測，按1.2.2方法處理并測定青霉噻唑酸鉀含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 青霉噻唑酸鉀配制方法

由圖1、圖2可知，青霉素鉀在堿性條件下與在酶作用下產(chǎn)物保留時間一致，峰面積基本相同，由此可知青霉素鉀在堿性條件下水解產(chǎn)物即為青霉噻唑酸鉀；因此，試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用青霉素鉀在pH=12條件下降解產(chǎn)物進(jìn)行配制。

圖1 青霉素鉀在pH=12時降解產(chǎn)物圖譜

圖2 青霉素酶作用于青霉素鉀后產(chǎn)物圖譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性

經(jīng)HPLC定性檢測后，青霉素鉀、青霉素酶、青霉噻唑酸鉀3種物質(zhì)的保留時間分別為7.182，5.875，4.904 min，因此3種物質(zhì)在分析過程中不會造成互相干擾。

2.3 液相色譜法對青霉噻唑酸鉀檢測方法研究

檢測結(jié)果見圖3和圖4。在添加青霉素酶后，樣品中的青霉素鉀不再檢出，青霉噻唑酸鉀則從樣品中檢出。此方法前處理簡單，能有效去除脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，青霉噻唑酸鉀分離度＞1.5。該方法優(yōu)勢在于簡單快速，全過程控制在30min內(nèi)，有效避免因青霉噻唑酸鉀降解所帶來的含量損失，為準(zhǔn)確定量提供保證。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率與精密度、檢出限試驗(yàn)

在2～60 mg/L范圍內(nèi)，青霉噻唑酸鉀線性較好，相關(guān)系數(shù)為0.99990（n=5），回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在濃度16.7～66.7mg/L范圍內(nèi)，回收率均在85%以上，組間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)。以信噪比為3計(jì)算儀器檢出限濃度為0.1 mg/L，按1.2.2前處理換算方法檢出限為0.2mg/L。

圖3 空白牛乳+青霉素鉀圖譜

圖4 空白牛乳+青霉素鉀+青霉素酶

2.5 實(shí)際樣品檢驗(yàn)測試

表2為對6份樣品檢測后的結(jié)果，結(jié)果表明陽性樣品可通過本方法被篩選出來，并得到青霉噻唑酸鉀含量。

表1 不同加標(biāo)量下的回收率及精密度

表2 高效液相法對原料乳的抽檢結(jié)果

3 結(jié)束語

根據(jù)以上結(jié)果，基本建立原料乳中青霉噻唑酸鉀的HPLC定量檢測方法，由此可作為判斷原料乳中是否添加β-內(nèi)酰胺酶的依據(jù)。該方法與傳統(tǒng)方法相比，準(zhǔn)確度較高，檢測時間控制在10min之內(nèi)，并且前處理方法簡單，有效降低因青霉噻唑酸鉀自身降解而造成的含量損失，適合大通量檢測。通過青霉噻唑酸鉀含量的確定，可進(jìn)一步研究其在適當(dāng)條件下的降解規(guī)律，從而為以青霉噻唑酸鉀為主要因子準(zhǔn)確表征原料乳中青霉素酶添加含量的研究做技術(shù)支撐。

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