酶解時間對燈盞花原生質體產量及活力的影響

李余潤 王馨 楊麗英 楊斌 寧玲 董志淵

摘 ? ?要：原生質體是進行單細胞測序和基因編輯研究的理想材料。為了研究不同酶解時間對燈盞花原生質體分離的影響，采用纖維素酶1%+果膠酶0.3%+半纖維素酶0.5%酶液處理愈傷組織懸浮細胞2，3，4，5，6 h，纖維素酶0.5%+果膠酶0.2%+離析酶0.5%酶液處理幼葉4，6，8，10，12，14，16 h。結果表明，不同酶解時間，燈盞花懸浮細胞和幼葉的原生質體產量及活力均差異顯著。懸浮細胞酶解5 h，原生質體的產量和活力達到最高，分別為3.73×105個·g-1 、75.84%;幼葉酶解12 h，原生質體產量最高，達到1.17×106個·g-1，酶解10 h，原生質體活力最高，為80.98%。葉片的原生質體產量和活力明顯高于懸浮細胞。

關鍵詞：燈盞花;原生質體;酶解時間;產量;活力

中圖分類號：S567.2 ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.06.004

Abstract： Protoplast is an ideal material for single-cell sequencing and gene editing. In order to optimize enzymatic hydrolysis times for the protoplast isolation of Erigeron breviscapus， suspension cells were incubated in an enzyme solution containing 1% cellulase， 0.3% pectinase and 0.5% hemicellulase for the 2，3，4，5，6 h and young leaves were incubated in an enzyme solution containing 0.5% cellulase， 0.2% pectinase and 0.5% macerozyme for the 4，6，8，10，12，14，16 h. The results showed enzymatic hydrolysis times significantly affect protoplast yield and viability. Five-hour enzyme incubation produced the maximum yield （3.73×105 protoplasts·g-1） and viability（75.84%） of protoplasts from suspension cells. Using young leaves as materials， the maximum yield（1.17×106 protoplasts·g-1） of the protoplasts was obtained at 12 h and the maximum viability（80.98%） was obtained at 10 h. The yield and viability of protoplasts from young leaves were both higher than those from suspension cells.

Key words： Erigeron breviscapus; protoplast; enzymatic hydrolysis time; yield; viability

燈盞花（Erigeron breviscapus）為菊科飛蓬屬多年生草本植物，全草入藥，具有祛風散寒、活血通絡止痛等功效[1]。藥理研究表明，燈盞花含有黃酮、咖啡酸酯、揮發油等有效成分，具有神經保護、心腦血管保護、抗氧化、抗癌以及抗炎等藥理作用[2]。以燈盞花為主要原料，已生產出燈盞花素片、燈盞細辛膠囊、燈盞細辛注射液以及燈盞花素注射液等藥品[3]。

燈盞花原料種植中，主要采用種子進行育苗[4]。異花授粉、自交不親和的繁育特性造成種植群體遺傳變異大，有效成分的不穩定[5-7]。生產中，急需一種高效的單株無性快繁技術，培育基因型一致、遺傳穩定的種苗。目前，以燈盞花葉片為外植體，初步建立了愈傷組織誘導、不定芽分化增殖及壯苗生根的快繁體系，但不定芽誘導系數較低[8-9]。關于愈傷組織離體再生形成不定芽的機制仍不清楚。因此，有必要分離葉片及其愈傷組織細胞，進行不同類型細胞脫分化、再生能力差異研究，為提高植株再生效率、優化無性快繁技術提供理論依據。

植物原生質體是指脫去細胞壁，由質膜所包圍的具有生活力的細胞。由于沒有細胞壁的阻礙，原生質體更容易從外界攝入DNA，更容易進行蛋白亞細胞定位[10-11]、基因編輯[12-13]等方面研究;同時，原生質體呈游離狀態，為單細胞測序研究，從單細胞水平分析植物發育的分子機制提供了可能[14]。目前，關于燈盞花原生質體的研究未見報道。

酶解是分離植物原生質體的主要方法。纖維素酶、半纖維素酶降解細胞壁中的纖維素、半纖維素，果膠酶降解連接細胞的中膠層。本研究以愈傷懸浮細胞、離體植株幼嫩葉片為材料，采用酶解法，分離制備燈盞花原生質體，試驗比較酶解時間對原生質體產量、活力的影響，為下一階段開展細胞異質性、離體再生機制研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

燈盞花（Erigeron breviscapus）植株取自云南省昆明市盤龍區，用于愈傷組織的誘導及懸浮培養;種子采自云南省彌渡縣，用于無菌苗的培養。

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織的誘導及懸浮培養 取生長健壯、無病蟲害的植株葉片，消毒后切成約（0.5×0.5）cm的方塊，接種到固體培養基（MS + 2， 4-D 2.0 mg·L-1+ BA 0.5 mg·L-1+ 活性炭2 g·L-1）上，25 ℃黑暗培養，誘導形成愈傷組織。繼代2次后，選取淺黃色、疏松的愈傷組織1 g，轉入50 mL液體培養液（MS+酸水解酪蛋白500 mg·L-1+ 2，4-D 1.0 mg·L-1+TDZ 0.2 mg·L-1）中。25 ℃黑暗條件下，120 r·min-1培養3 d，獲得懸浮細胞。

1.2.2 無菌苗培養 選取飽滿種子，接種在固體培養基（1/2 N6 + 酸水解酪蛋白1 g·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1 + 活性炭2 g·L-1）上，培養獲得離體植株。葉片用于原生質體的分離。

1.2.3 酶解時間篩選 ? 懸浮細胞過60目細胞篩后，800 r·min-1離心5 min，吸除上清液，保留底部細胞層，加入10 mL酶液（纖維素酶1%+果膠酶0.3%+半纖維素酶0.5%）。25 ℃黑暗條件下，60 r·min-1酶解處理2，3，4，5，6 h。

稱取生長旺盛的離體植株幼嫩葉片0.7 g，切成1～2 mm寬的細條，放入10 mL酶液（纖維素酶0.5% +果膠酶0.2% + 離析酶0.5%）中。25 ℃黑暗條件下，60 r·min-1酶解處理4，6，8，10，12，14，16 h。

1.2.4 原生質體純化收集 酶解結束后，70 μm尼龍濾網過篩，收集酶液，500 r·min-1離心5 min，棄上清。沉積于底部的原生質體用13% CPW洗滌液（27.2 mg·L-1 KH2PO4、101.0 mg·L-1 KNO3、1 480.0 mg·L-1 CaCl2、246.0 mg·L-1 MgSO4、0.16 mg·L-1 KI、0.025 mg·L-1 CuSO4、13%（m·V-1）甘露醇，pH值 6.0）懸浮清洗，置換3次（800 r·min-1，5 min）。液體培養液重懸保存。

1.2.5 原生質體的產量測定 采用血球計數板測定原生質體產量，重復3次。統計中央大方格內25個中方格的原生質體數目，根據如下公式計算原生質體密度、原生質體產量：

原生質體的密度（個·mL-1）= 中央大方格內的原生質體數×10×1 000

原生質體產量（個·g-1） =（原生質體密度×懸浮液總體積）/用于分離原生質體的材料鮮質量

1.2.6 原生質體的活力檢測 采用二乙酸熒光素（FDA）-酚番紅花紅雙染色法檢測原生質體活力，重復3次。取純化后的原生質體懸浮液20 μL于載玻片上，依次加入2 μL 1%FDA和0.1% 酚番紅花紅染色液，室溫靜置孵育2 min，熒光顯微鏡下藍光激發鏡檢，發綠色熒光的原生質體具有活性，呈紅色的無活性。隨機選取細胞數目大于10的5個視野進行統計。采用如下公式統計原生質體活力：

原生質體活力（%）= 發綠色熒光的原生質體數/原生質體總數×100

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0軟件進行顯著性檢驗和相關性分析，Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶解時間對懸浮細胞原生質體分離的影響

采用纖維素酶1% + 果膠酶0.3% + 半纖維素酶0.5%的酶液處理懸浮細胞2，3，4，5，6 h。結果表明，未經酶解的懸浮細胞單個或多個粘連成團，細胞形狀不規則，多呈卵形、月型、橢圓形;酶解2 h，細胞開始分離，形成少量圓形的原生質體;酶解3，4 h，隨酶解時間延長，原生質體產量、活力均逐漸增加;酶解5 h，形成少量細胞碎片，原生質體產量和活力達到最高，分別為3.73×105個·g-1、75.84%;酶解6 h，細胞碎片明顯增多，產量和活力均逐漸下降（圖1）。方差分析表明，不同酶解時間，原生質體產量、活力差異顯著（P<0.05）。酶解5 h的原生質體產量、活力均顯著高于其它4個酶解時間。相關性分析表明，原生質體的產量與活力存在顯著性相關（r = 0.949，P<0.05）。

2.2 酶解時間對幼葉原生質體分離的影響

采用纖維素酶0.5% + 果膠酶0.2% + 離析酶0.5%的酶液處理幼葉4，6，8，10，12，14，16 h。結果表明，酶解4 h，細胞主要呈團狀，形成的原生質體數量較少;酶解6，8，10，12 h，隨酶解時間延長，原生質體產量逐漸增加，其中酶解12 h，原生質體產量最高，達到1.17×106個·g-1，酶解14，16 h，細胞碎片增加，原生質體產量逐漸下降。同時，酶解4，6，8，10 h，原生質體活力逐步增加，酶解10 h，原生質體活力最高，為80.98%，酶解12，14，16 h，原生質體活力逐漸下降（圖2）。方差分析表明，不同酶解時間，原生質體產量、活力差異顯著（P<0.05），酶解10 h的原生質體活力極顯著地高于其它6個酶解時間。

3 討論與結論

3.1 原生質體產量及活力變化規律

酶解時間是影響原生質體分離的重要因素。酶解時間短，原生質體不能完全分離，產量較低;酶解時間過長， 細胞易破碎和失活， 原生質體產量、活力也較低[15-18]。本研究也獲得相似的結果。采用不同酶解時間處理燈盞花懸浮細胞和幼葉，原生質體的產量及活力差異顯著，均呈現先增加后降低的變化趨勢，其中懸浮細胞原生質體的產量與活力變化達到顯著相關性。

3.2 材料對酶解時間的影響

材料是影響酶解時間的重要因素。幼嫩材料如子葉、幼葉等，適宜酶解時間一般較短，大約為6～10 h[19-22]。愈傷組織可能受繼代次數的影響，適宜酶解時間變幅較大。以大豆（Glycine max）繼代培養15～20 d 的愈傷組織分離制備原生質體，酶解5 h原生質體產量和活力最高[23]。而苜蓿（Medicago sativa）繼代10～12次的愈傷組織，需酶解12 h有活力的原生質體產量才能達到最大值[24]。本研究發現，燈盞花懸浮細胞和幼葉的原生質體產量、活力以及適宜酶解時間存在較大差異。懸浮細胞酶解5 h，原生質體產量、活力達到最高值，而幼葉酶解10 h原生質體活力最高，酶解12 h原生質體產量最高，其原生質體產量和活力普遍高于懸浮細胞。該研究結果可能與兩種材料的組織結構及細胞活力差異有關。懸浮細胞為單細胞或小細胞團，能與酶液充分接觸，所需酶解時間較短，較長酶解時間，易造成原生質體破碎。同時，懸浮細胞培養過程中可能發生的活力下降情況，影響了原生質體的活力。幼葉只能逐層接觸酶液，其適宜的酶解時間較長。由于幼葉取自活體植株，細胞活力較強，分離制備的原生質體活力也可能較高。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典（2005版）[M]. 北京： 化學工業出版社， 2005： 100.

[2]郭欣， 林珊， 吳麗明， 等. 燈盞細辛化學成分及藥理作用研究進展[J]. 中成藥， 2019， 41（2）： 393-402.

[3]田利華， 趙離鐘， 顧佳， 等. 燈盞花素上市品種概況以及新劑型研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（19）： 3719-3722.

[4]俞宏淵， 陳宗蓮. 燈盞細辛的家化栽培[J]. 云南植物研究， 2002， 24（3）： 115-120.

[5]李鵬， 黨承林. 短葶飛蓬（Erigeron breviscapus）的花部綜合特征與繁育系統[J]. 生態學報， 2007， 27（2）： 571-578.

[6]楊生超， 文國松， 劉雪玲， 等. 燈盞花種質資源遺傳關系的ISSR分析[J]. 中草藥， 2010， 41（9）：1523-1527.

[7]楊生超， 張雪峰， 李黎， 等. 燈盞花種質資源燈盞乙素和咖啡酸酯含量[J]. 中國中藥雜志， 2009， 34（2）： 239-240.

[8]吳毅歆， 謝慶華， 桑林， 等. 燈盞細辛的組織培養與快速繁殖[J]. 植物學通報， 2005， 22（1）： 54-57.

[9]董志淵， 楊麗英， 王馨， 等. 燈盞細辛離體葉片再生植株的研究[J]. 中國林副特產， 2014（4）： 5-8.

[10]楠迪娜， 薛敏， 唐寬剛，等. 沙冬青子葉原生質體瞬時表達體系的建立及其 AmDREB1 蛋白的亞細胞定位[J]. 植物科學學報，2018，36（4）： 562-568.

[11]谷戰英， 楊若楠， 陳昊. 油桐葉肉細胞原生質體分離及瞬時轉化體系的建立[J]. 林業科學， 2018， 54（1）： 46-53.

[12]ANDERSSON M， TURESSON H， OLSSON N， et al. Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery[J]. Physiologia plantarum， 2018， 164（4）： 378-384.

[13]KIM H， KIM S T， RYU J， et al. CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing[J]. Nature communications， 2017， 8： 14406.

[14]RYU K H， HUANG L， KANG H M， et al. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells[J]. Plant physiology， 2019， 179（4）： 1444-1456.

[15]李玉珠， 陶茸， 王娟， 等. 百脈根原生質體的分離和酶解條件的研究[J]. 草地學報， 2010， 18（6）： 798-804.

[16]岳備， 黃玉蘭， 林曉婷， 等. 酶解條件對黃瓜原生質體分離效果的影響[J].安徽農業科學， 2014， 42（19）： 6145-6147.

[17]俞超， 楊瀟， 王忠華， 等. 葡萄愈傷組織制備原生質體的影響因素研究[J]. 果樹學報， 2013， 30（3）： 433-436.

[18]陳愛萍， 羅玉鵬， 姜婷娜， 等. 不同酶液組合及酶解時間對普通紅豆草原生質體游離的影響[J].新疆農業大學學 報， 2008， 31（2）： 29-32.

[19]趙紅娟， 張博， 陳愛萍， 等. 酶解對苜蓿子葉原生質體分離效果的影響[J]. 草地學報， 2008（1）： 50-53.

[20]屈紅恩， 王烈峰， 劉仁林， 等. 不同酶解條件對金邊瑞香幼葉原生質體分離的影響[J]. 福建林業科技， 2009， 36（4）： 149-152.

[21]許傳俊， 陳益輝， 李愛貞， 等. 大花蕙蘭原生質體分離純化[J]. 亞熱帶植物科學， 2014， 43（3）： 212-215.

[22]趙艷艷， 陳雙雙， 房克鳳， 等. 板栗下胚軸原生質體的分離與純化[J]. 果樹學報， 2013， 30（6）： 994-997.

[23]蘇彤， 姚陸銘， 張鑫， 等. 大豆愈傷原生質體的制備和培養方式探究[J]. 大豆科學， 2018， 37（5）： 741-747.

[24]王娟， 李玉珠， 師尚禮. 苜蓿愈傷組織原生質體游離與培養[J]. 草地學報， 2010， 18（2）： 258-262.