反義ATM多核苷酸對喉鱗狀細(xì)胞癌ATM mRNA、蛋白影響的體外研究

李 麗，馮 俊，王朝莉，敬保遷△

(1.川北醫(yī)學(xué)院病理教研室;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科;3.川北醫(yī)學(xué)院分子生物研究所，四川 南充 637007)

喉癌是頭頸部原發(fā)于上皮的常見惡性腫瘤之一，目前主要治療還是以手術(shù)和放射治療為主，放療可以充分保護(hù)喉的發(fā)聲功能。ATM是與放射敏感性有關(guān)的基因，ATM蛋白表達(dá)水平差異與細(xì)胞放射敏感性程度之間存在一定的關(guān)系［1］。本研究中，我們使用反義多核苷酸作用于ATM以研究ATM mRNA、蛋白表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)由四川大學(xué)華西醫(yī)院上呼吸道實(shí)驗(yàn)研究中心惠贈。

1.2 試劑

Lipofectamine 2000、Opti-MEM I、Trizol kit購自美國Carlsbad公司;GAPDH單克隆抗體、SYBR Ex-Script RT-PCR Kit、SYBR Green Master Mix 試劑盒購自Takara公司;ATM單克隆抗體、BCIP/NBT購自美國Santa Cruz公司。

1.3 目標(biāo)序列的選擇及多核苷酸的合成

于NCBIGenBank查出人ATM序列，設(shè)計(jì)反義ATM核苷酸(AS:5'-GTACTAGACTCATGGTTCACAATTT-3');正義ATM核苷酸(Sen:5'-AAATTGTGAACCATGAGTCTAGTAC-3');錯(cuò)配 ATM核苷酸(Mis:5'-AAAATGTAAACCATAAGTCTAGAAC-3')。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR 引物設(shè)計(jì)

將GAPDH作為內(nèi)參對照，按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.5 多核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞

將生長良好的Hep-2約2×105，置于6孔板中培養(yǎng)，待其生長到70% ～80%時(shí)備用。取0.8 ug的反義ATM核苷酸、正義ATM核苷酸、錯(cuò)配ATM核苷酸及Lipofectamine 2000分別加入到Opti-MEM I中，在常溫下作用5 min。而后將核苷酸與 Lipofectamine 2000在常溫下作用20 min后加入Hep－2細(xì)胞中，在37°C，5%CO2孵箱中作用。6 h后用PBS洗兩次。最后用RPMI-1640取代PBS，在37°C孵箱中過夜備用。

1.6 Western blot分析

收集1.5所述的細(xì)胞1×107，以冷 PBS清洗3次，以裂解緩沖液制備細(xì)胞總蛋白，總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜)，用5%的脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜上的蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn)，加入ATM單克隆抗體(1∶100)4℃過夜，GAPDH作為陽性對照，加入二抗后BCIP/NBT試劑顯色、照相。

1.7 real-time quantitative PCR 分析

收集1.5所述的細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明書提取hep-2細(xì)胞總RNA，然后進(jìn)RNA電泳，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行目的基因ATM和內(nèi)標(biāo)基因GAPDH Real Time PCR。擴(kuò)增條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s、60℃ 1 min，42個(gè)循環(huán)，每組及內(nèi)標(biāo)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染AS-ODNs后hep-2細(xì)胞中ATM蛋白表達(dá)

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后，進(jìn)行Western blot分析。從圖1可以看出AS組蛋白表達(dá)明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質(zhì)體)組蛋白表達(dá)低，從圖2(各組蛋白表達(dá)的灰度掃描)可以更準(zhǔn)確的得出 AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對照組)的蛋白相對表達(dá)量以AS-lipo組最低，為(48.14±5.53)%。用SPSS 18.0軟件分析各組蛋白表達(dá)灰度可以得出，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Real-time quantitative PCR檢測轉(zhuǎn)染ATM ASODNs后hep-2細(xì)胞中ATM mRNA的表達(dá)

將多核苷酸AS、Sen、Mis轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后，進(jìn)行PCR分析，從圖3可以看出AS組mRNA表達(dá)明顯較 Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質(zhì)體)組 mRNA 表達(dá)低，AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2 組(對照組)的 mRNA相對表達(dá)量以 AS-lipo組最低，為(11.03±2.51)%，用SPSS 18.0軟件分析各組mRNA表達(dá)可以得出，AS 組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sen、Mis、lipo、hep-2組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

參與DNA損傷修復(fù)磷酸化過程的蛋白包括ATM、P53等在乳腺癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、肺癌、皮膚癌以及膀胱癌等的早期階段就能檢測得到［2－4］，這就暗示在腫瘤的早期階段就會發(fā)生DNA損傷，甚至在許多腫瘤的野生型P53基因功能失活和基因組不穩(wěn)定性改變之前就已出現(xiàn)。Raju［5］證實(shí)P53基因?qū)υ┗虻倪^表達(dá)作出反應(yīng)需要ATM激酶—一個(gè)對DNA雙鏈斷裂做出反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑。Mohammad A［6］推測在成人的急性淋巴細(xì)胞型白血病的誘導(dǎo)和緩解期，ATM缺乏能增加化療藥物對白血病治療的敏感性。Jian等［7］通過反義多核苷酸作用于小鼠頭頸鱗癌細(xì)胞株(SCCⅦ)ATM基因，從而增強(qiáng)了頭頸鱗癌細(xì)胞對放射線的增敏性。江繼平等［8］用ATM反義多核苷酸降低了喉癌細(xì)胞ATM蛋白的表達(dá)。因此，我們設(shè)計(jì)ATM反義多核苷酸從不同成面來驗(yàn)證反義ATM能否抑制喉鱗狀細(xì)胞癌ATM的表達(dá)。

本研究顯示，進(jìn)行Western blot分析可以看出AS組蛋白表達(dá)明顯較Sen、Mis、hep-2、lipo(脂質(zhì)體)組蛋白表達(dá)低，為48.14% ±5.53%，AS組與 Sen、Mis、lipo、hep-2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR分析可以看出AS、Sen、Mis、lipo與 hep-2組(對照組)的mRNA相對表達(dá)量以 AS-lipo組最低，為(11.03 ±2.51)%，AS 組與 Sen、Mis、lipo、hep-2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染反義ATM組的ATM蛋白和ATM mRNA的表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染正義ATM組、無關(guān)序列組及對照組，這就表明ATM表達(dá)的抑制是由于反義ATM多核苷酸序列介導(dǎo)的。因此，將反義ATM多核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌可以抑制ATM mRNA和ATM蛋白的表達(dá)水平。已有研究［1］表明，ATM蛋白表達(dá)水平差異與細(xì)胞放射敏感性程度之間存在一定的關(guān)系 。江繼平等［8］用脂質(zhì)體將反義ATM導(dǎo)入頭頸鱗癌細(xì)胞系(SCCⅦ)中，轉(zhuǎn)染24 h后ATM蛋白表達(dá)量減少，與轉(zhuǎn)入無關(guān)序列相比，轉(zhuǎn)染反義ATM的SCCⅦ細(xì)胞在輻照后表現(xiàn)出內(nèi)在放射敏感性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中我們用反義ATM使喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中ATM mRNA、蛋白的表達(dá)降低，故我們推測其亦有可能使喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對放射治療的敏感性增強(qiáng)。

［1］Lei L，Michael S，Randy JL.Cellular responses to ionizing radiation damage［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2001，49(4):1157 －1162

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［8］江繼平，馮 俊，唐嗣泉，等.反義ATM在體外對喉鱗狀細(xì)胞癌ATM蛋白表達(dá)影響的研究［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，26(5):394－396