纖維素酶提取洋蔥多糖工藝研究

傅冬和，李 適，蔡汶莉，吳遠杰

（1.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學園藝園林學院植物資源工程系，湖南 長沙 410128）

“蔬菜皇后”洋蔥是集營養、醫療和保健于一身的特色蔬菜，產量高，多糖等活性成分豐富。近幾年來，酶技術在多糖等生物活性物質的提取中的應用已引起廣泛關注，選擇理想的酶可以在較溫和的條件下分解植物組織，提高目標物質的提取率。纖維素是洋蔥細胞壁的主要成分，是阻礙其多糖等大分子物質浸出的主要屏障，纖維素酶可破壞細胞壁，利于胞內成分溶出，使多糖提取率明顯高于常規水提醇沉法[1]。目前洋蔥多糖提取工藝報道較多的主要有水提醇沉法、微波輔助凍融法和超聲波輔助浸提等[2-6]，用纖維素酶法提取的系統研究的相關報道還不多見。水是既環保又經濟的一種溶劑，為此，該研究擬采用纖維素酶水解洋蔥細胞壁，以水作為溶劑浸提洋蔥多糖類化合物，通過系統研究以期獲得洋蔥多糖提取的最佳工藝，為洋蔥多糖的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

試驗材料為市售新鮮紫皮洋蔥。試驗試劑包括：葡萄糖標準品（中國藥品生物制品檢定所），纖維素酶（活性單位大于50 000 U/g，銳陽生物），濃硫酸、苯酚、95%乙醇、無水乙醇、丙酮（均為市售、國產、分析純）。

試驗儀器為：UV-VIS紫外分光光度計（日本島津）；FA21045電子天平（上海精科天平廠）；H-2050R離心機（長沙市八方科學儀器有限公司）；恒溫水浴鍋(北京國華醫藥器械廠)；循環水式多用真空泵（河南鞏義英峪予華儀器廠）；超聲波清洗機（上海BRANSON公司）；LGJ-10真空冷凍干燥機（亞星儀科）；常用玻璃器皿。

1.2 試驗方法

1.2.1洋蔥粗多糖的制備和檢測新鮮洋蔥洗凈去皮，切薄片后于-18℃的條件下緩凍一定時間，冷凍干燥，粉碎，過60目篩即得洋蔥粉。取洋蔥粉500.0 g，用5倍質量體積的80%乙醇回流脫脂2次，每次2.0 h，抽濾，收集濾渣50℃烘干備用。準確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，按1∶25的固液比加入蒸餾水，再加入一定量的纖維素酶，調節pH，在水浴鍋中一定溫度下浸提一定時間，滅酶活，4 000 r/min離心20 min，取上層清液。再采用減壓蒸餾濃縮提取液至50 mL，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇進行醇析，在冰箱中放置過夜，然后離心。沉淀物分別用丙酮和無水乙醇洗滌，揮干溶劑后冷凍干燥得洋蔥粗多糖，用于測定洋蔥多糖的提取率。洋蔥多糖的檢測方法為硫酸-苯酚法[7]。

1.2.2洋蔥多糖提取單因素試驗按方法1.2.1，準確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，提取溫度固定為50℃，固液比為 1∶25，pH 值為 5.5，提取 1 次，酶的添加量為洋蔥粉的0.2%，提取時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0 h，以測定洋蔥多糖提取率為指標，考查提取時間對洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，固液比為1∶25，提取時間為2.5 h，pH值為5.5，提取1次，酶的添加量為洋蔥粉的0.2%，提取溫度分別為30、40、50、60℃，以測定洋蔥多糖提取率為指標，考查提取溫度對洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，提取溫度為50℃，固液比為1∶25，提取時間為2.5 h，提取1次，pH值為5.5，纖維素酶的添加量分別為洋蔥粉的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，以測定洋蔥多糖提取率為指標，考查酶添加量對洋蔥多糖提取率的影響。

按方法1.2.1，準確稱取脫脂洋蔥粉10.0 g，固定提取溫度為50℃，提取時間為2.5 h，固液比為1:25，提取1次，調節pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0，以測定洋蔥提取液多糖提取率為指標，考查提取液pH值對洋蔥多糖提取率的影響。

1.2.3洋蔥多糖提取正交試驗洋蔥多糖提取正交試驗的因素分別為提取溫度、提取時間、纖維素酶的添加量及介質pH值，根據單因素試驗結果，確定各因素的水平，設計4因素3水平的L9（34）正交試驗。

1.2.4驗證試驗及對比試驗根據纖維素酶水解法提取洋蔥多糖的正交試驗確定的提取時間、溫度、pH值及纖維素酶的添加量的工藝參數，料液比為1∶25，比較加與不加纖維素酶對洋蔥粉多糖的提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

按照參考文獻[7]方法，繪制標準曲線，計算獲得洋蔥多糖的線性方程為C=9.610 3 A-0.004 1（式中C為被測液中多糖含量，A為被測液吸光值），相關系數為R2=0.9992。

2.2 洋蔥多糖提取單因素試驗

2.2.1提取時間對洋蔥多糖提取率的影響圖1顯示，提取時間在2.5 h以內時，洋蔥多糖含量隨提取時間的延長而增加；提取2.5 h時，洋蔥多糖最高含量達9.50%；提取時間超過2.5 h后，提取率略有下降。提取初期，多糖因洋蔥細胞壁的破壞很容易浸出，隨著提取時間的延長，浸出速度逐漸減慢，達到動態平衡后，延長浸提時間，多糖的提取率沒有增加。

圖1 提取時間對洋蔥多糖提取率的影響

圖2 提取溫度對洋蔥多糖提取率的影響

2.2.2提取溫度對洋蔥多糖提取率的影響圖2顯示，提取溫度在30～50℃之間，洋蔥多糖提取率隨溫度的升高而增加，50℃時達到最大值9.54%；溫度在50℃以上時，多糖的浸出率下降。這主要是因為溫度再升高，酶的活性下降，且可能有部分多糖分解，所以多糖提取率反而下降。

2.2.3酶添加量對洋蔥多糖提取率的影響圖3顯示，洋蔥多糖的提取率隨酶的添加量的增加而升高；當添加量為0.3%時，提取率增加到9.33%；實際上酶的后3種添加濃度下多糖的提取率差別很小。酶的量比較少時，洋蔥細胞壁破壞不夠，多糖浸出受阻；當酶添加量達到一定量后，能夠較完全水解洋蔥細胞壁，有利于其多糖的釋放，提取率增加。

圖3 酶添加量對洋蔥多糖提取率的影響

2.2.4 pH值對洋蔥多糖提取率的影響圖4顯示，當pH值為5.0時，洋蔥多糖的提取率最高，達到9.38%；pH值為6.0時，提取率略有下降，說明在pH 5.0～6.0的范圍內酶的活性變化不大；在其他的pH值的條件下，提取率均較低。

圖4 pH值對洋蔥多糖提取率的影響

2.3 洋蔥多糖提取的正交試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，為了確定洋蔥多糖的最佳提取參數，以10.0 g洋蔥粉為原料，料液比為1∶25，以提取時間、提取溫度、pH值和纖維素酶添加量4因素3水平設計正交試驗，見表1。測定各處理的洋蔥多糖提取率，試驗結果見表2。通過表2極差分析得出洋蔥多糖提取率的影響因素大小為：提取時間＞提取溫度＞pH值＞酶添加量。試驗結果顯示洋蔥多糖最佳提取工藝條件為：A2B2C3D1，即酶添加量為0.2%，pH值為5.5，提取溫度為50℃，提取時間為2.5 h，此條件下提取測得洋蔥中多糖含量為9.71%。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果

2.4 驗證性試驗

根據正交試驗所確定的洋蔥多糖的提取工藝參數條件，精密稱取6份脫脂洋蔥粉，均按固液比1∶25，在 pH 5.5、50℃的條件下提取 2.5 h，其中 3 份均加0.2%的纖維素酶，另3份均不加酶，分別取平均值計算洋蔥中多糖的提取率。結果顯示，加酶處理的多糖平均提取率為9.78%，不加酶處理的多糖平均提取率為4.91%。

3 討論與結論

通過正交試驗系統研究，確定提取最佳工藝參數：酶的添加量為0.2%，pH值為5.5，提取溫度為50℃，提取時間為2.5 h，此條件下洋蔥多糖的提取率可達9.78%。

試驗洋蔥干燥前先采用冷凍，冷凍時新鮮洋蔥細胞中水分膨脹，使細胞部分得到破壞，有利于多糖的提取，并能減少纖維素酶的使用量。

洋蔥的多糖含量高，且有良好的生物學活性，能增強免疫力以及有抗氧化等活性[8]，是一種很好的保健食品。用傳統的水提法提取洋蔥多糖的提取率低。研究結果表明，不用酶處理的洋蔥多糖提取率只有4.91%，而用纖維素酶水解細胞壁的方法提取，可以使洋蔥多糖的提取率提高達到9.78%，且反應條件溫和、工藝簡單易行、多糖得率提高近一倍。纖維素酶通過將細胞壁主要結構成分纖維素分解為還原糖，有助于增加多糖的溶出，從而提高多糖的得率，因此酶解方法在洋蔥多糖的提取應用中具有很強的優越性。用本方法制備的多糖沒有經過純化，只是粗多糖，如果進一步純化提高純度，則活性更強，應用價值更高，應用前景將十分廣闊。本研究結果可為洋蔥多糖工業化生產提供理論依據，也為將來用現代高新技術開發洋蔥多糖的研究提供參考。

[1]張智芳，林文庭，陳燦坤.植物多糖提取工藝的研究進展[J].海峽預防醫學雜志，2008，14（3）：18-20.

[2]張鋒倫，吳素玲，孫曉明，等.洋蔥水溶性糖不同提取工藝的提取效果研究[J].時珍國醫國藥，2009，20（4）：34-35.

[3]馮長根，吳悟賢.洋蔥的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫藥雜志，2003，37（1）：63.

[4]郭 梅，趙 靖，王 娜，等.洋蔥多糖的水浸提取工藝條件研究[J].食品研究與開發.2011，32（4）：59-62.

[5]黃愛民，馬 林，楊 華，等.洋蔥多糖的提取工藝改進[J].安徽農業科學，2010，38（10）：5113-5114.5124.

[6]馬 釗，李景明，李麗梅.洋蔥多糖提取工藝研究[J].食品工業科技，2005，26（5）：98-100.

[7]董 群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚-硫酸法測定水溶性糖和寡糖含量的研究[J].中國藥學雜志，1996，31（9）：550-553.

[8]張 強，牟雪姣，周正義，等.洋蔥多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].食品與發酵工業，2007，33（1）：138-141.