高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法測定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的不確定度評定＊

翟晚楓 張春水，高利生

（中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京 100038） （公安部物證鑒定中心，北京 100038）

高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法測定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的不確定度評定＊

翟晚楓 張春水，高利生

（中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京 100038） （公安部物證鑒定中心，北京 100038）

依據(jù)JJF 1059–1999《測量不確定度評定與表示》，以檢測大麻樹脂中四氫大麻酚含量的實驗為例，評定了采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法進行含量測定的不確定度。建立了高效色譜外標(biāo)工作曲線法測定樣品含量的數(shù)學(xué)模型，分析了不確定度的來源并給出了量化結(jié)果，合成擴展不確定度為0.15%（k=2）。

高效液相色譜；外標(biāo)法；不確定度；大麻樹脂

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，在測量結(jié)果的完整表述中，應(yīng)包括測量不確定度［1］。當(dāng)前，在高效液相色譜領(lǐng)域，分析工作者進行不確定度評定的定量方法主要集中于外標(biāo)單點定量法［2-5］。由于外標(biāo)工作曲線法測量不確定度的評定較為復(fù)雜，因此報道較少［6-7］。外標(biāo)工作曲線法與單點定量法相比，具有準(zhǔn)確、可靠等顯著優(yōu)勢，筆者以檢測大麻樹脂中四氫大麻酚含量實驗為例，對采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法的測量結(jié)果進行了不確定度評定和探討。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Prominenece UFLC型，附帶LC-20AD XR型泵、SIL-20AC XR型進樣器、SPD-20A型檢測器、CTO-20AC 型柱溫箱、數(shù)據(jù)處理軟件LC solution，日本島津公司；

電子分析天平：XP105DR型，感量為0.01 mg，瑞典Mettler公司；

超聲振蕩器：KQ3200型，昆山市超聲儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：德國Sigma公司；

純水制備系統(tǒng)：Synergy UV型，美國Millipore公司；

移液槍：容量為100～1 000 μL，德國Eppendorf公司；

瓶口移液器：標(biāo)稱容量10 mL，德國Brand公司；

進樣針：容量分別為50，100，250 μL，瑞士Hamilton公司；

四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品：(100±0.5) μg／mL，美國Cerilliant公司；

大麻樹脂樣品：案件中收繳；

甲醇：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

實驗用水為去離子水，由蒸餾水經(jīng)Millipore公司生產(chǎn)的Synergy UV型純水系統(tǒng)制備而得。

1.2 色譜條件

色譜柱：島津Inertsil ODS-SP柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水；梯度程序：以乙腈-水（體積比為70∶30）為初始流動相，然后有機相體積分?jǐn)?shù)以2%／min升至96%；柱溫：40℃；流速：1 mL／min；進樣量：10 μL。

1.3 實驗方法

（1）樣品前處理

使用瑪瑙研缽將樣品研磨成粒度均勻的粉末，使用高精度天平等量稱取樣品粉末6份，分別裝入一次性試管中，用瓶口移液器加入20 mL（V1）甲醇，密封后以1 500 r／min振蕩10 min，離心5 min，用移液管移取1 mL（V2）上清液裝入一次性試管，再用瓶口移液器加入20 mL（V3）甲醇，搖勻后使用移液器移取約1.5 mL溶液裝入自動進樣瓶中。

（2）四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg／mL）分別用甲醇稀釋成濃度分別為c1，c2，c3，c4，c5的標(biāo)準(zhǔn)使用液，供高效液相色譜儀分析（每種濃度進樣3次），用最小二乘法建立外標(biāo)工作曲線。稀釋的具體過程如下：

使用注射器將安瓿瓶中1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)樣品全部吸取后注入容量瓶中，之后使用該注射器吸入稀釋溶劑甲醇潤洗注射器和安瓿瓶，將剩余有效成分全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，重復(fù)多次，定容至10 mL，配制成0.01 mg／mL（c1）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

使用標(biāo)稱容量250 μL的微量進樣針吸取0.01 mg／mL四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液500 μL（分兩次吸取），轉(zhuǎn)移至1 mL單標(biāo)線容量瓶中，定容，配制成0.005 mg／mL（c2）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別使用不同標(biāo)稱容量的微量進樣針吸取一定體積的0.01 mg／mL四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，轉(zhuǎn)移至單標(biāo)線容量瓶中定容，分別配制成0.002，0.001，0.000 5 mg／mL（c3，c4，c5）的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（3）樣品測定

將高效液相色譜峰面積響應(yīng)值分別代入外標(biāo)工作曲線，得到對應(yīng)濃度的預(yù)估值并分別計算出6份樣品的含量，取平均值作為測定結(jié)果。

2 不確定度來源分析

高效液相色譜（外標(biāo)工作曲線）法測定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的數(shù)學(xué)模型：

式中：wi——單份樣品中四氫大麻酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

cpred——由工作曲線計算得到的單份樣品溶液的質(zhì)量濃度，mg／mL；

V1——溶解樣品時加入甲醇的體積，mL；

V2——從甲醇一次提取液中移取樣品溶液的體積，mL；

V3——稀釋時加入甲醇的體積，mL；

mi——單份樣品的質(zhì)量，mg；

n——樣品份數(shù)。

參照式(1)、式(2)，根據(jù)JJF 1059-1999［1］，高效液相色譜外標(biāo)法測定大麻樹脂中四氫大麻酚含量的測量不確定度主要來源于以下幾個方面：采用校準(zhǔn)工作曲線計算引入的不確定度（包括不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)的隨機變化、導(dǎo)致系列標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差的隨機效應(yīng)）、用于測定的樣品質(zhì)量m引入的不確定度（來源于天平稱量樣品的過程）、溶解樣品的溶劑體積V1引入不確定度、從甲醇一次提取液中移取V2體積的樣品溶液引入的不確定度、稀釋時加入的溶劑體積V3引入的不確定度、測量重復(fù)性引入的不確定度urep（包括樣品不均勻性、技術(shù)人員個人熟練程度和其它因素引入的不確定度）。

3 不確定度分量的量化

3.1 應(yīng)用外標(biāo)工作曲線計算引入的不確定度u(c)

3.1.1 測量不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)的隨機變化引入的預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，A)

通常通過對若干對數(shù)值（c，A）的加權(quán)或未加權(quán)最小二乘法回歸來確定工作曲線A=ac+b中的常數(shù)a和b。可利用工作曲線通過樣品中被分析物產(chǎn)生的峰面積響應(yīng)值A(chǔ)obs計算出該分析樣品濃度cpred。

由于A的隨機變化引入的預(yù)估值cpred的不確定度可從工作曲線數(shù)據(jù)獲得，適用公式(3)［8］：

式中：var(cpred)——未加權(quán)數(shù)據(jù)預(yù)估值cpred的方差；

s——殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；

a——工作曲線斜率；

p——預(yù)估值點的進樣次數(shù)，p=2；

n——工作曲線上各點測量次數(shù)之和，n=15；

b——工作曲線截距。

本實驗建立的外標(biāo)法工作曲線方程為A=89 794 350c－3 337.032，預(yù)估值cpred=0.003 93 mg／mL，依據(jù)式(3)，(4)，測量不同濃度的響應(yīng)值A(chǔ)隨機變化引入預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，A) =3.05×10-5mg／mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(cpred，A) =u(cpred，A)／cpred=7.77×10-3。

3.1.2 工作曲線中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液賦值引入的不確定度u(cpred，c)

u(cpred，c)來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備過程及從標(biāo)準(zhǔn)溶液到標(biāo)準(zhǔn)工作液的稀釋過程。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

根據(jù)制造商說明，本實驗使用的四氫大麻酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度c0=（100±0.5）μg／mL，服從矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c0)=0.5／=0.289(μg／mL)，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c0)=u(c0)／c0=0.002 89。

（2）移取標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

本實驗中，除0.01 mg／mL濃度點使用注射器從標(biāo)準(zhǔn)樣品中取樣并稀釋，其余4種濃度的稀釋均使用微量進樣針從0.01 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液中取樣。以c2=0.005 mg／mL濃度點為例，這一步驟引入的不確定度來自以下三個方面：微量進樣針最大容量允差引入的不確定度；微量進樣針排出溶液體積引入的不確定度；溫度變化引入的不確定度。

以使用250 μL進樣針移取溶液為例：

本實驗所用標(biāo)稱容量為250 μL的微量進樣針已檢定合格，容量允差為±1.5%［9］。按照矩形分布，不確定度分量u250，1=1.5%×250／=2.165(μL)。

操作者將吸取的溶液排出微量進樣針這一過程中，排出液體積的不確定度可通過多次測量的重復(fù)性實驗來評估。本實驗采用移取10次稱量得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為不確定度計算，u250，2=0.201 μL。

容量瓶在20℃校準(zhǔn)，實驗室的溫度在(20±4)℃之間變動。該影響引起的不確定度可通過計算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進行評估。由于液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者即可。有機液體膨脹系數(shù)1.0×10-3／℃。因此，標(biāo)稱容量為V針的微量進樣針產(chǎn)生的體積變化為±V針×4×1.0×10-3。按照矩形分布，u250,3=250

將3個不確定度分量合成，使用250 μL微量進樣針移取標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=2.250 μL，相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u250，rel=u250／250=0.009 00。同理，可計算得到u100，rel=0.011 8，u50，rel=0.017 5。

（3）容量瓶定容引入的不確定度

使用容量瓶定容引入的不確定度來源于：

①校準(zhǔn)不確定度。檢定合格的1 mL A類單標(biāo)線容量瓶容量允差為±0.007 mL，10 mL A類單標(biāo)線容量瓶容量允差為±0.020 mL［10］。服從矩形分布，校準(zhǔn)不確定度由最大容量允差除以求得。

②充滿容量瓶至刻度的變化引起的不確定度。可通過充滿該容量瓶的重復(fù)性實驗來評估，并直接作為不確定度進行計算。10 mL A類單標(biāo)線容量瓶的重復(fù)性不確定度為0.006 41 mL，1 mL A類單標(biāo)線容量瓶的重復(fù)性不確定度為0.001 62 mL。

③溫度引起體積變化引入的不確定度。計算方法同3.1.2（2）。

將三個不確定度分量合成，計算得10 mL容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u10，rel=0.002 66，同理，可計算得1 mL容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel=0.004 93。

（4）引起標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差隨機效應(yīng)的合成

由標(biāo)準(zhǔn)值不確定度引起的預(yù)估值cpred的不確定度u(cpred，ci)近似值為u(ci)／n，n是用于校準(zhǔn)的ci值的數(shù)目（本實驗n=5）［8］。

對于c1=0.01 mg／mL的濃度點，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度=3.93×10-5mg／mL，u(cpred，c1)=uc(c1)／n =7.86×10-6mg／mL。

c2，c3，c4，c5各濃度點的標(biāo)準(zhǔn)值ci=c1×吸取體積／定容體積。以c2=0.005 mg／mL濃度點為例，其相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc，rel(c2)=0.014 2，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(c2)=uc，rel(c2)×c2=7.10×10-5mg／mL，u(cpred，c2) =uc(c2)／n =1.42×10-5mg／mL。依此計算，得u(cpred，c3)，u(cpred，c4)，u(cpred，c5)分別為7.14×10-6, 2.68×10-6,1.86×10-6mg／mL，則導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)濃度賦值ci誤差的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(cpred，c)按式（5）計算：

將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式（5）得u(cpred，c)=1.80×10-5mg／mL。

3.1.3 應(yīng)用工作曲線計算引入的不確定度合成

合成3.1.1與3.1.2節(jié)計算得到的兩個分量，得到用工作曲線計算引入的不確定度u(cpred)

3.2 稱量樣品引入的不確定度u(m)

本實驗所用天平的計量證書標(biāo)明其稱量的最大允差為0.09 mg，稱量重復(fù)性（變動性）為0.04 mg（依據(jù)天平校準(zhǔn)證書），包含因子k=，標(biāo)準(zhǔn)不確定度。凈重由兩次稱量操作所得（一次為皮重，另一次為毛重），每一次稱量均為獨立觀測結(jié)果，合成不確定度

3.3 樣品稀釋過程引入的不確定度

溶解樣品加入溶劑甲醇的體積V1、從甲醇一次提取液中移取V2體積的樣品溶液、再次稀釋加入的溶劑體積V3這三項引入的不確定度均源于移液器最大容量允許誤差、移液器排出體積的不確定性以及溫度變化這3個方面。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算方法見3.1.2（2），計算結(jié)果見表1。

表1 各不確定度分量表

3.4 測量重復(fù)性引入的不確定度urep

在重復(fù)性條件下，對同一樣品從取樣開始重復(fù)測量n次，n次測定的平均值作為結(jié)果，則測量重復(fù)性引入的不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，計算結(jié)果見表1。

4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計算

將表1中各不確定度分量按式（6）合成，求得w的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc,rel(w)：

5 擴展不確定度的計算及測量結(jié)果表示

95%置信概率下，取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×uc(w)%=0.15%，樣品中四氫大麻酚的含量表示為(4.67±0.15)%，k=2。

6 結(jié)語

確定預(yù)估值cpred不確定度的標(biāo)準(zhǔn)方法有三種［8］：從計算所得的方差和協(xié)方差來獲取；從校準(zhǔn)數(shù)據(jù)獲取；從用來導(dǎo)出工作曲線的軟件提供的信息獲取。第一種方法計算繁瑣，第三種不具有普適性，而第二種方法不但方法相對簡便可行，公式易于理解，而且通過引入殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差間接反映出線性相關(guān)系數(shù)的大小，使得不確定度的評定更加可靠，因此筆者認(rèn)為第二種方法為首選方法。

實驗結(jié)果表明，采用高效液相色譜外標(biāo)工作曲線法測定大麻樹脂中四氫大麻酚含量，測量結(jié)果的不確定度主要是由外標(biāo)工作曲線以及多份樣品的重復(fù)測量引起的，重復(fù)性誤差對小體積移液器或容量瓶影響較大，稀釋樣品步驟直接造成不確定度增大，采用較大體積的移液器和容量瓶可減小不確定度。

［1］ JJF 1059-1999 測量不確定度評定與表示［S］.

［2］ 王威，倪春芳，張潤生.高效液相色譜法測定海洛因含量的不確定度評定［J］.中國司法鑒定，2008(2): 28-30.

［3］ 屈穎. 布洛芬緩釋膠囊中布洛芬含量的測量不確定度評估［J］.天津藥學(xué)，2008，20(1): 8-10.

［4］ 汪輝，曹小彥，彭新凱，等.高效液相色譜法測定小麥粉與大米粉中甲醛次硫酸氫鈉含量的不確定度評定［J］.食品科學(xué)，2009，30(12): 205-208.

［5］ 李東剛，李春娟，吳凡，等.高效液相色譜法測定巴氏殺菌乳中糠氨酸不確定度的評定［J］.化學(xué)分析計量，2008，17(3): 7-9.

［6］ 徐靖，汪歡晃，劉娟，等.超高效液相色譜法測定化妝品中孕激素的不確定度［J］.化學(xué)分析計量，2008，18(3): 11-14.

［7］ 李志梅，孫東衛(wèi).外標(biāo)法測定飲用水中無機元素的［J］.中國計量，2009(8): 72-73.

［8］ CNAS-GL06 化學(xué)分析中不確定度的評估指南［S］.

［9］ JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.

［10］ JJG 646-2006 移液器檢定規(guī)程［S］.

Uncertainty Evaluation of Determination of Tetrahydrocannabinol in Cannabis Resin by HPLC External Standard Working Curve Method

Zhai Wanfeng
（Department of Forensic Science， Chinese People’s Public Security University， Beijing 100038， China）
Zhang Chunshui， Gao Lisheng
（Institute of Forensic Science Ministry of Public Security P.R.C， Beijing 100038， China）

The determination uncertainty of tetrahydrocannabinol in cannabis resin by HPLC external standard working curve method was evaluated based on JJF 1059-1999 Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement. The mathematical models to evaluate the uncertainty of quantitative results of HPLC external standard working curve method were established, and each source and uncertainty component was analysized, and the combined expanded uncertainty was 0.15%(k=2).

HPLC; external standard method; uncertainty; cannabis resin

O657.7

：A

：1008-6145(2012)05-0008-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.05.002

*公安部重點研究計劃支持項目（2009ZDYJGAES024）;中國人民公安大學(xué)學(xué)科建設(shè)與研究生創(chuàng)新項目（YX11120）

聯(lián)系人：翟晚楓；E-mail: betty871211.student@sina.com

2012–07–22