山銀花皂苷提取條件優(yōu)化研究

黃 佳 ，虢小翊 ，彭國平，黃 河，饒力群

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

山銀花（Flos Lonicerae Confusae）為忍冬科忍冬屬多年生木質(zhì)藤本干燥花蕾或帶初開的花。在山銀花與金銀花的鑒別上，原來均以綠原酸和木犀草苷為檢測對象，該鑒別意義不大。2010年藥典增加山銀花中專屬性較強的灰氈毛忍冬皂苷乙（Macranthoidin B）與川續(xù)斷皂苷乙（Dipsacoside B）的總含量不得少于5.0%，它們皆為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷。其中灰氈毛忍冬皂苷乙的分子式為C65H106O32，川續(xù)斷皂苷乙的分子式為C53H86O22，該兩種皂苷的提取工藝和藥理試驗研究均未見報道。有報道采用浸提法HPLC-ELSD聯(lián)用一次性檢測綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量，但其未考慮這兩種皂苷的提取工藝。本試驗采用熱回流提取工藝進行研究，確定其最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

山銀花供試品：湘蕾金銀花（以下簡稱湘蕾），采自湖南隆回縣小沙江鎮(zhèn)；灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品：純度99%，購自成都曼斯特公司；乙醇、正丁醇：分析級，湖南化工研究院精細(xì)化工研究所；冰乙酸、乙腈：色譜級，上海德正化工有限公司。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

FW177中草藥粉碎機（天津泰斯特），ALZ04電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），電熱水浴鍋WB-2000（上海浦東物理光學(xué)儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠），高效液相色譜儀Agilent 1100（安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取方法 稱取干湘蕾粉末5.0 g，放入圓底燒瓶中，乙醇回流提取，提取液過濾除渣后濃縮至干，用少量水溶解后正丁醇萃取，減壓濃縮至浸膏狀，水溶解并定容至150 mL。

1.3.2 單因素試驗 （1）乙醇濃度對提取效果的影響：根據(jù)1.3.1方法，料液比1∶10，提取時間90 min，提取溫度70℃，提取次數(shù)為1次，乙醇濃度分別設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%。

（2）料液比對提取效果的影響：根據(jù)1.3.1方法，提取時間90 min，提取溫度70℃，乙醇濃度70%，提取次數(shù)為 1 次，料液比分別設(shè)為 1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16。

（3）提取溫度對提取效果的影響：根據(jù)1.3.1方法，料液比 1∶12，提取時間 90 min，乙醇濃度 70%，提取次數(shù)為 1次，提取溫度分別為50、60、70、80、90℃。

（4）提取時間對提取效果的影響：根據(jù)1.3.1方法，料液比 1∶12，乙醇濃度 70%，提取溫度 80℃，提取次數(shù)為1次，提取時間分別為75、90、105、120、135 min。

1.3.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進行L9（33）正交試驗研究，確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.4 分析方法 （1）HPLC檢測條件：色譜柱為Boston Inc 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈和0.5%乙酸，梯度洗脫（表1）；檢測波長208 nm；流速 0.5 mL/min，柱溫 40℃。

表1 梯度洗脫程序

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對照品2.4 mg、1 mg，水定容至1 mL EP管中，分別配成濃度為2.4 mg/mL、1 mg/mL的儲備液。然后用移液槍精密稀釋成2.2、2.0、1.8、1.6、1.4 mg/mL 和 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL。進樣20 μL，記錄相應(yīng)的峰面積。以峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）供試品中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙含量的測定：采用HPLC檢測條件，各稀釋3倍后，進樣20 μL。以峰面積定量，分別計算灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的測定結(jié)果

2.1.1 對照品測定結(jié)果 灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=5 087.6 X+2 865.4（R2=0.998 6）、Y=11 117 X+569.5（R2=0.994 5）。線性考察結(jié)果表明，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙進樣量分別在 1.4～2.4 mg/mL；0.1～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)峰面積和進樣量線性關(guān)系良好，出峰時間分別為25.1、27.4 min。

2.1.2 供試品測定結(jié)果 由圖1可知供試品與對照品出峰時間幾乎一致，峰型完整。可見可利用面積外標(biāo)法計算灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的含量。

圖1 山銀花供試品溶液HPLC圖譜

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度 由表1可知，隨著乙醇濃度的增大，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙總提取率也隨之升高。這說明這兩種皂苷易溶于乙醇，且乙醇濃度越高，總提取率也越高。當(dāng)濃度達(dá)到80%，趨于平緩。故取70%、80%、90%3個濃度水平進行正交試驗。

表1 乙醇濃度對總提取率的影響

2.2.2 料液比 由表2可知，隨著料液比的增加總提取率升高，當(dāng)大于1∶14時提取率開始下降。故取1∶10，1∶12，1∶14 3 個料液比水平進行正交試驗。

表2 料液比對總提取率的影響

2.2.3 提取溫度 由表3可知，隨著溫度的升高，總提取率增加，這是由于溫度的增加加快了這兩種皂苷的溶解擴散速度，增大了溶解度。當(dāng)溫度達(dá)到70℃，提取率開始下降，這是由于灰氈毛忍冬皂苷乙的酯苷鍵受高溫的影響不穩(wěn)定，易分解產(chǎn)生次級苷。故取60、70、80℃ 3個溫度水平進行正交試驗。

表3 提取溫度對總提取率的影響

2.2.4 提取時間 由表4可知，隨著提取時間的增加，總提取率增加。當(dāng)時間增加到90 min時總提取率趨于平穩(wěn)。故取90、105、120 min 3個提取時間水平進行正交試驗。

表4 提取時間對總提取率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上進行三水平四因素的正交試驗，因素和水平見表5，試驗結(jié)果見表6。

表5 正交試驗因素與水平表

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表6看以看出，影響總提取率的因素順序為：B>C>A>D，最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即乙醇濃度90%，料液比 1∶10，提取溫度 80℃，提取時間 120 min。

2.4 驗證試驗

在正交試驗得到的最佳工藝條件下進行驗證試驗，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙總提取率可達(dá)到7.9%，見圖2。

圖2 山銀花供試品溶液HPLC圖譜

3 小結(jié)與討論

試驗采用HPLC法測定山銀花中灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的總含量，方法簡便，結(jié)果可靠。采用有機溶劑乙醇回流提取的方法，通過對山銀花的回流提取過程中影響有效成分的單因素進行考察，然后采用正交試驗對提取工藝條件進行最優(yōu)化。并在優(yōu)化條件下進行驗證試驗，結(jié)果表明在乙醇濃度90%，料液比1:10，提取溫度80℃，提取時間120 min的條件下，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙總提取率達(dá)到7.9%。為評價山銀花藥材的內(nèi)在質(zhì)量提供了較全面的參考。

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