豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的克隆及原核表達(dá)

楊曉燕，劉 航，楊順利，尹雙輝，尚佑軍，田永強(qiáng)

（1.蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒[1]，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），病毒基因組為無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒。病毒顆粒平均直徑為17nm，呈20面體對(duì)稱[2]。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將PCV分為PCV1和PCV2兩個(gè)基因型，基因組大小約為1.7kb，其中PCV1對(duì)豬為非致病性，但廣泛存在豬體內(nèi)及豬源代細(xì)胞系。PCV2感染常常被認(rèn)為可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、皮炎腎病綜合征、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病，但臨床上以PMWS最為常見[3-5]。

PCV2的ORF3基因是除ORF1、ORF2外較大的閱讀框[6]，位于基因組671～357 bp位堿基(復(fù)制起始點(diǎn)作為序列起始)，大小為314 bp，編碼104個(gè)氨基酸。ORF3對(duì)應(yīng)著ORF1（Rep蛋白氨基酸103～207 aa）的反向互補(bǔ)序列和Cap蛋白B淋巴細(xì)胞抗原表位（185～211 aa），與ORF2蛋白的一個(gè) T淋巴細(xì)胞抗原表位共用201～211 aa，功能尚不完全清楚[8]。而其他閱讀框編碼產(chǎn)物的功能和特性目前尚不清楚。為了探討ORF3基因結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，研究以實(shí)驗(yàn)室分離的PCV2菌株為材料，對(duì)ORF3基因進(jìn)行完整克隆，并在大腸桿菌中克隆表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株與基因

實(shí)驗(yàn)室保存的從臨床表現(xiàn)為PMWS仔豬脾臟中分離的PCV2毒株；大腸桿菌 JM109，BL21（DE3）菌株，載體 pGEX-6p-1（Invitrogen公司）。

1.2 酶與試劑

引物、PCR試劑、DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（大連寶生物有限公司）；T4 DNA連接酶、BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶，Taq酶（promega公司）；核酸 Makers，蛋白 Makers，TMB，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG抗體（Sigma公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與目的基因的PCR擴(kuò)增

按照Genbank中PCV2 ORF3的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下：

P1：5′-TTCGGATCCATGGTAACCGTCCCACCACT-3′

P2： 5′-CTGGTCGACCCTGATGGAATGTGGAGC-3′

為了便于克隆，在引物P1中加入了BamH I酶切位點(diǎn)，在P2中加入了Sal I酶切位點(diǎn)，同時(shí)為了方便表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化，刪去了終止密碼子，引物由上海生工合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5 min，94℃變性 1 min，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，循環(huán)30次后，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的PCV2 ORF3基因片段與載體pGEX-6p-1分別用BamH I+Sal I雙酶切，用T4 DNA連接酶將ORF3克隆到載體pGEX-6p-1中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)BamH I+Sal I雙酶切及PCR鑒定，篩選出重組質(zhì)粒，命名為pGEX-6p-1-ORF3。將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.5 ORF3基因的誘導(dǎo)表達(dá)及其可溶性分析

將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，將含有重組質(zhì)粒的單菌落在新鮮的 5mL LB 培養(yǎng)基（含 100 μg/mL，Amp+），37℃振蕩培養(yǎng)過夜（180 r/min），陰性對(duì)照為含空白載體pGEX-6p-1的受體菌。次日按1%的接種量將重組菌pGEX-6p-1-ORF3接種到新鮮的含Amp+的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600值約為0.6～0.8左右時(shí)，取1 mL作為未誘導(dǎo)樣品，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h，收集1 mL菌液，用120 g/L分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

將BL21轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收獲菌體進(jìn)行超聲波破碎，離心分離后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)目的蛋白的可溶性。

1.6 Western-blot鑒定

將SDS-PAGE凝膠的蛋白帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以封閉液（TBST+1%BSA）封閉過夜，與PCV2陽(yáng)性豬多抗血清37℃溫浴1 h，經(jīng)充分洗滌后，再轉(zhuǎn)入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記羊抗豬IgG中，37℃溫浴1 h，DAB顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORF3的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定

用P1/P2引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小約為314 bp的片段（如圖1）。大小與預(yù)期結(jié)果相符。將該片段與經(jīng)雙酶切作用后的原核載體pGEX-6p-1連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)BamH I+Sal I雙酶切及PCR鑒定，出現(xiàn)約314 bp大小的片段（圖2、圖3）。經(jīng)測(cè)序，結(jié)果表明所連序列即為目的序列。

圖1 ORF3基因的PCR擴(kuò)增

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3的PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3的酶切鑒定

2.2 PCV2 pGEX-6p-1-ORF3的誘導(dǎo)表達(dá)、分析

通過SDS-PAGE電泳分析在E.coli中重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3大小約為37 kD（pGEX-6p-1載體所帶的GST標(biāo)簽大小為26 kD）（如圖4），在37℃條件下表達(dá)的pGEX-6p-1-ORF3主要以包涵體形式存在。進(jìn)一步調(diào)整誘導(dǎo)條件，降低誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、延長(zhǎng)誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間，但仍是大部分以包涵體形式存在，對(duì)包涵體進(jìn)行純化，如圖5所示。

圖4 pGEX-6p-1-ORF3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)

圖5 pGEX-6p-1-ORF3表達(dá)產(chǎn)物可溶性鑒定和純化

2.3 pGEX-6p-1-ORF3表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3與抗PCV2的豬血清相互作用后，利用化學(xué)底物進(jìn)行顯色，可以觀察到明顯的特異性蛋白條帶（圖6），重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3能夠和PCV2陽(yáng)性血清發(fā)生特異性相互作用，說明其與天然的ORF3蛋白一樣，具有作為候選抗原應(yīng)該具有兩種特征之一，即反應(yīng)原性。

圖6 重組蛋白pGEX-6p-1-ORF3的Western blot檢測(cè)

3 討 論

ORF3蛋白是新發(fā)現(xiàn)的PCV2非結(jié)構(gòu)蛋白，是近年來的研究熱點(diǎn)。位于基因組互補(bǔ)鏈上，ORF1基因的內(nèi)部，方向與ORF1基因相反[6]。Liu等采用點(diǎn)突變技術(shù)使PCV2 ORF3基因功能缺失，并用缺失ORF3功能的PCV2進(jìn)行 PK-15細(xì)胞的感染試驗(yàn)以驗(yàn)證ORF3的功能，表明ORF3編碼蛋白是在病毒復(fù)制中屬非必需的蛋白，它是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而在致病性方面發(fā)揮作用。其他試驗(yàn)也表明，ORF3編碼蛋白與 PCV2的致病性也有一定的關(guān)系，由ORF3編碼的蛋白可以影響病毒衣殼蛋白在機(jī)體內(nèi)的免疫效果[9]。ORF3蛋白的缺失或變異均能減弱PCV2的致病。

研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，但重組蛋白以包涵體的形式存在，需要變性、濃縮并復(fù)性。為此，本研究用Ni2N TA蛋白純化試劑盒（QIA GEN公司），對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化、濃縮，濃縮后的蛋白濃度可達(dá)6.11 mg/mL，該質(zhì)量濃度完全能滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。為了恢復(fù)重組蛋白的免疫學(xué)活性，研究利用蛋白復(fù)性試劑盒proteinrefolding kit（Novagen公司）對(duì)其進(jìn)行透析復(fù)性，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)純化復(fù)性的重組蛋白能夠特異性的結(jié)合PCV2多克隆抗體，表明目的蛋白具有與PCV2相同的抗原性，可用于PCV2 ORF3單克隆抗體及PCV2的ELISA檢測(cè)方法研究。試驗(yàn)通過PCR擴(kuò)增得到了ORF3基因，并將其連接到了表達(dá)載體pGEX-6p-1上，得到了陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORF3，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，但未獲大量融合表達(dá)，重組蛋白以包涵體形式存在，免疫印記試驗(yàn)均證實(shí)重組表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性，命名為pGEX-6p-1-ORF3，為進(jìn)一步研究ORF3蛋白的生物活性、功能及對(duì)PCV2致病機(jī)理的影響奠定了基礎(chǔ)。

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