黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用

陳婭萍 史廷嬌 高淞文 唐丁卯 鄧 葵 李春艷

1．湖南省吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院07級(jí)臨床醫(yī)學(xué)，湖南 吉首 416000;2．湖南省吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)教研室，湖南 吉首 416000

黃瓜香學(xué)名蔓莖堇菜、葡付堇，屬堇菜科，堇菜屬(Viola diffusa Ging)，多年生草本植物，是盛產(chǎn)于湖南湘西等地區(qū)的一種中草藥。其主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)，具有清除自由基，抑制過(guò)氧化損傷作用［1－2］。本實(shí)驗(yàn)室以黃瓜香為研究對(duì)象，對(duì)它的活性成分——總黃酮進(jìn)行提取分離，并用傳代培養(yǎng)的肝HapG2細(xì)胞，通過(guò)H2O2建立氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型，研究總黃酮對(duì)肝HapG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為實(shí)現(xiàn)黃瓜香提取物在臨床上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、TGL216G高速臺(tái)式離心機(jī)、UV－3系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、全自動(dòng)生化分析儀 (均為上海美譜達(dá)儀器有限公司)。25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、6孔培養(yǎng)板 (均購(gòu)于碧云天公司)。

1.1.2 試劑和藥品 黃瓜香醇提物，傳統(tǒng)方法醇提、濃縮，臨用時(shí)用雙蒸水稀釋成所需濃度 (實(shí)驗(yàn)所用劑量均以生藥計(jì))，并用0.22um濾過(guò)膜濾過(guò)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS液(均由碧云天公司提供)，雙氧水 (成都化工原料有限公司)，二醛 (MDA)試劑盒、基噻唑藍(lán) (MTT)、ALT測(cè)試劑盒(均購(gòu)于碧云天公司)，無(wú)水乙醇、乙醚等其它化學(xué)試劑均為分析純，雙蒸水 (吉首大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.3 細(xì)胞 肝細(xì)胞為HapG2細(xì)胞，購(gòu)于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 黃瓜香總黃酮的分離純化

本實(shí)驗(yàn)所用黃瓜香采自湖南湘西，夏末采集，全植物干燥后粉碎，加入60%的乙醇，80℃條件下提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、乙醚萃取、再過(guò)濾，得黃瓜香提取物 (總黃酮)。

1.2.2 肝細(xì)胞培養(yǎng)及損傷模型的建立

將原代HapG2細(xì)胞，加入胰蛋白酶溶液8ml，37℃消化，蓋好瓶蓋在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，倒掉胰酶，加入含10%牛胎血清的新鮮培養(yǎng)基10ml，稀釋成含5×106/L個(gè)細(xì)胞細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中和6孔板 ，96孔培養(yǎng)板100μl/孔，6孔板2ml/孔，置 CO2培養(yǎng)箱 (5%CO2，95%空氣，37℃)中培養(yǎng)2h。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后分組實(shí)驗(yàn):對(duì)照組:只加入含牛胎血清的培養(yǎng)基孵育1h;H2O2損傷模型組 (H2O2):加入0.6mmol/L H2O210ul，孵育1h，建立氧化應(yīng)激損傷模型;黃瓜香－1.0、3.0、10.0、30.0干預(yù)組:每組分別加入終質(zhì)量濃度為 1.0mg/L、3.0mg/L、10.0mg/L、30.0mg/L的黃瓜香及0.6mmol/L的H2O2孵育1h;每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 MTT法檢測(cè) 將三個(gè)分組分別加入 DMSO 100 ul/孔，按試劑盒說(shuō)明步驟，待甲臜完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)570nm處讀取吸光度 (A 570)。

1.2.4 ALT的檢測(cè) 將分組實(shí)驗(yàn)后肝細(xì)胞經(jīng)離心 (1800r/min，10min)后收集上清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，用全自動(dòng)生化分析儀速率法檢測(cè)，結(jié)果以U/孔表示。

1.2.5 MDA含量的測(cè)定 用胰蛋白酶消化分組培養(yǎng)至貼壁的HapG2細(xì)胞細(xì)胞，收集2×106細(xì)胞，用PBS洗2次。待細(xì)胞分散后，將各組細(xì)胞的培養(yǎng)液倒掉，將細(xì)胞裂解后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明步驟操作，測(cè)定MDA含量，可見(jiàn)光分光光度計(jì)532 nm測(cè)上清液的吸光值，吸光值表示丙二醛含量的多少，吸光值越大，丙二醛含量越高，結(jié)果以mmol/孔計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，計(jì)量指標(biāo)用方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相差顯著;P＜0.01時(shí)為相差非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)方法，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲臜顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周?chē)淞颗c細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比［3］。因此MTT常常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。采用熒光免疫法測(cè)定細(xì)胞活性 (MTT)，以實(shí)驗(yàn)分組為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制柱狀圖，見(jiàn)圖1。

由圖1可知，與模型組比較:對(duì)照組HapG2細(xì)胞增殖活躍 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細(xì)胞增殖隨黃瓜香濃度的增加而逐漸增加 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時(shí)P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時(shí)P＜0.01)，說(shuō)明黃瓜香總黃酮能促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的肝HapG2細(xì)胞的增值。

2.2 黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響

ALT是一種非血漿特異酶，是肝功能檢驗(yàn)的重要指標(biāo)，是反映肝細(xì)胞受損最敏感的指標(biāo)［4］。采用全自動(dòng)生化分析儀速率法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液ALT的水平，觀測(cè)黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響程度，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，與模型組比較:對(duì)照組HapG2細(xì)胞無(wú)明顯受損 (P＜0.01);黃瓜香各劑量干預(yù)組HapG2細(xì)胞受損明顯降低 (黃瓜香濃度為3.0mg/L時(shí)P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時(shí)P＜0.01)，說(shuō)明黃瓜香總黃酮能降低H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損，具有保護(hù)肝HapG2細(xì)胞的作用。

2.3 黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

MDA是介導(dǎo)自由基損傷的重要物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)、核酸、堿基、生物胺、磷脂等含有氨基的物質(zhì)作用而發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致生物大分子及生物膜結(jié)構(gòu)的損傷［5］。其作為生物膜磷脂中多不飽和脂肪酸受自由基攻擊而產(chǎn)生的終產(chǎn)物之一，可以反映出體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的水平。分光光度法檢測(cè)細(xì)胞丙二醛 (MDA)水平，檢測(cè)黃瓜香總黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞受損的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，與模型組比較:對(duì)照組肝HapG2細(xì)胞無(wú)明顯脂質(zhì)過(guò)氧化損傷 (P＜0.01);黃瓜香各劑量組HapG2細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度隨黃瓜香濃度的增加逐漸降低(黃瓜香濃度為 3.0mg/L時(shí) P＜0.05，黃瓜香濃度為10.0mg/L時(shí)P＜0.01)，說(shuō)明黃瓜香總黃酮能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低H2O2誘導(dǎo)的HapG2細(xì)胞的損傷。

3 結(jié)論與討論

黃瓜香化學(xué)成分主要為黃酮、糖類(lèi)、粘液質(zhì)［6］。植株總黃酮含量為2.39%，根總黃酮含量為1.08%，細(xì)胞懸浮物總黃酮含量為0.76%［7］。本實(shí)驗(yàn)采用 H2O2誘導(dǎo)肝HapG2細(xì)胞損傷，建立體外氧化應(yīng)激損傷模型。實(shí)驗(yàn)選用了0.6mmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷1h，使肝細(xì)胞處于尚能保護(hù)的自由基環(huán)境，保證了實(shí)驗(yàn)的可行性，與某些文獻(xiàn)報(bào)道的濃度基本吻合［8］。

本實(shí)驗(yàn)顯示:黃瓜香總黃酮具有很強(qiáng)的體外抗氧化能力，可以促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的肝HapG2細(xì)胞的增殖，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)中的肝HapG2細(xì)胞具有保護(hù)作用。黃瓜香濃度為3.0mg/L時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，濃度為10.0mg/L有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示黃瓜香能有效減低氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與生物類(lèi)黃酮藥理作用一致:黃瓜香水提物中所含有的黃酮，能提供大量的酮羥基還原自由基，從而起到抗自由基作用。且體外試驗(yàn)還表明:黃瓜香提取物對(duì)·OH均具有良好清除作用，且濃度愈大清除率愈高［9］，表明黃瓜香提取物是良好的羥自由基清除劑，能減輕H2O2引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，并對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用。弄清楚黃瓜香抗肝損傷的機(jī)制，并對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)，不僅具有重要的社會(huì)效益而且具有重要經(jīng)濟(jì)效益。

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