重組可逆轉水蛭素制備及活性測定

黃 程，李紅亮，馮一建，陳 勇，陳海容，王 林，范 開，

(1.重慶理工大學藥學與生物工程學院重慶 400054;2.重慶富進生物醫藥有限公司 ，重慶 400041)

水蛭素(Hirudin)是醫用水蛭(Hirudo medicinals)的唾液腺分泌的一種活性多肽，是目前已知的自然界中最強的抗凝血因子。水蛭素與凝血酶親和力極高，能以摩爾比1∶1結合形成非共價復合物［1］。水蛭素與凝血酶結合后，使凝血酶失去裂解纖維蛋白原為纖維蛋白的能力，并阻止纖維蛋白的凝固和凝血酶催化的止血反應以及凝血酶誘導的血小板反應，達到抗凝目的［2］。重組水蛭素與凝血酶結合后具有不可逆轉性。臨床研究表明，重組水蛭素在治療HIT(肝素介導的血小板減小癥)病人時，出血率為 18.8% ～20.4%［3］，在進行預防全髖關節置換術時，深靜脈血栓的出血率為17.0%。該出血副作用限制了重組水蛭素在臨床上的廣泛應用［4］。

比伐盧定(Bivalirudin)是通過化學合成的含20個氨基酸的水蛭素衍生物，是直接的、特異的、可逆性的凝血酶抑制劑。臨床結果表明，比伐盧定幾乎無出血風險。比伐盧定C端12個氨基酸為凝血酶識別結合位點，N端的D-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4區域是與凝血酶活性區相互作用的位點，二者與游離型或與結合型凝血酶催化位點和底物識別位點發生特異性結合，從而直接抑制凝血酶的活性［5］。因凝血酶可水解比伐盧定Arg3和Pro4之間的肽鍵，使其失去抗凝活性，所以比伐盧定對凝血酶的抑制作用可逆而短暫［6］。

水蛭素分子如蝌蚪狀，由2個結構區域組成:頭部N端為球狀致密結構，它與凝血酶的活性位點結合，抑制其催化活力;尾部C端主要為帶負電的羧基末端，與凝血酶的陰離子結合外側位點(即纖維蛋白原識別位點，FRE)結合，抑制凝血酶與纖維蛋白原的相互作用。水蛭素分子頭部和尾部之間存在一個指狀結構從復合物中部突出，不與凝血接觸，屬功能非必需區，不參與凝血酶的抑制作用［7－9］。

由于N端引入了D-Phe-Pro-Arg-Pro的結構，因此比伐盧定具有可逆轉性。D-Phe-Pro-Arg-Pro的結構可被凝血水解，水解后比伐盧定喪失抗凝活性，從而使凝血酶活性恢復。本研究將水蛭素的指狀區域第45位至第48位氨基酸Thr-Pro-Lys-Pro替換為 Phe-Pro-Arg-Pro，通過重組構建和表達，獲得與比伐盧定類似的能夠被凝血酶降解且保留原水蛭素活性的新型可逆轉水蛭素(命名為G4-HV1)，避免了重組水蛭素在臨床應用時的出血風險。

1 材料和方法

1.1 材料

質粒pPIC9和pPIC9K、大腸桿菌TOP10F’和畢赤酵母GS115，以及天然水蛭素(WT-HV1)均由重慶富進生物醫藥有限公司保存;比伐盧定(Bivalirudin)由成都凱捷生物醫藥科技發展有限公司提供;基因合成、測序及克隆所需的工具酶均購自于寶生物(大連)有限公司;凍干人凝血酶國家標準品購于中檢所;Chromozyme TH(生色底物)購于Roche;Phenyl Sepharose 6 Fast Flow購于Amersham pharmacia biotech;C18 柱(XB-C18，5 μm，10 mm×150 mm)來自Welch Material;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

根據G4-HV1的cDNA序列，同時設計5’和3’端酶切位點為 Xho I和Not I，送由寶生物(大連)有限公司全基因合成，插入pMD-19T載體，命名為pMD-19T-G4-HV1。

用XhoⅠ和NotⅠ雙酶切空白質粒pPIC9和pMD-19T-G4-HV1，回收雙酶切空白質粒pPIC9后約8 000 bp片段，以及pMD-19T-G4-HV1約200 bp的片段。連接回收的2個片段轉入TOP10F’，用LB+Amp平板篩選重組子，然后用SalⅠ和SacⅠ切下經鑒定的pPIC9-G4-HV1上約3 000 bp片段，插入經相同酶切的pPIC9K上，構建成重組質粒pPIC9K-G4-HV1，經酶切鑒定后送寶生物(大連)有限公司測序。

1.2.2 電轉化酵母

將SacⅠ線性化測序正確的重組質粒pPIC9KG4-HV1進行濃縮，然后電轉入宿主菌Pichia pastrois GS115，鋪于MD(1.34%YNB，4 ×10-5%Biotin，2%Dextrose，1.5%Agar)平板，篩選陽性克隆。濃縮、電轉及篩選具體操作方法見Invitrogen Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手冊。

1.2.3 高表達菌種篩選

由于pPIC9K載體帶有Kanamycin抗性基因，能使陽性轉化子產生Geneticin(G418)抗性，且抗性隨整合到宿主菌上的外源基因的增加而增加［10］，因此選用1 ～5 g/L G418的YPD平板來進行篩選。挑取單菌落分別點于含不同濃度的G418 YPD平板，30℃培養箱培養3～5 d。隨機挑取在不同濃度G418的YPD平板上長出的重組子菌落，接種于含100 Ml BMGY培養液的1 000 mL搖瓶中，30℃搖床培養16～20 h。至 A600為2～6時加入BMMY培養液100 mL，30℃繼續培養24～96 h。每隔 24 h取樣，并補入 0.5%甲醇。用SDS-PAGE監測G4-HV1表達情況。

1.2.4 純化

搖床表達菌液經高速冷凍離心機離心后，收集上清液。按1 mol/L補入(NH4)2SO4，進行phenyl柱純化。用不同濃度(NH4)2SO4進行洗脫。將洗脫后的樣品通過Welch C-18柱進行反相純化，流動相:A液為5%乙腈，95%水，0.1%TFA;B液為95%乙腈，5%水，0.1%TFA。經 0～40%，30 min梯度洗脫。流速為 2 mL/min，在波長280 nm下進行檢測，以獲得G4-HV1。

1.2.5 生物學活性測定

分別取:50 mM Tris-HCL、0.1%PEG6000、pH值為7.8的chromozym TH溶液，用稀釋液溶解稀釋chromozym TH為2 mM。用稀釋液溶解稀釋凝血酶為20 IU/ml制成凝血酶溶液。供試樣品稀釋至1 mg/mL。按 1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800 稀釋，每個樣品取樣 50 μL 于96孔酶標板，每個梯度3個復孔，再分別加入50 μL凝血酶溶液，置37℃保溫5 min。分別加入50 μL chromozym TH溶液，置37℃保溫2 min。分別加入250 μL乙酸終止反應，再補加600μL蒸餾水，測定OD405值。以水蛭素含量為橫坐標，OD值為縱坐標作一條線性直線，計算直線橫坐標截距，即為一個抗凝單位水蛭素量。以此計算水蛭素比活性。

1.2.6 G4-HV1與凝血酶結合動力學

分別取 50 mM Tris-HCL，0.1%PEG6000，pH值為7.8的溶液配制成2.0 μg/mL 的BivalirudinWT-HV1 和 G4-HV1 各500 μL，與人凝血酶(20.0 IU/mL)500 μL 混合。37 ℃水浴作用 0、5、10、20、30、60 min后，取出置冰上。取每個稀釋度50 μL樣品于96孔酶標板中(復孔)，再分別加入50μL人凝血酶(20 IU/mL)，置37℃保溫5 min。每孔再加入 50 μL chromozym TH 生色底物試劑(2 mM，Roche公司出品)，37℃反應2 min。每孔加入25 μL乙酸終止反應，405 nm測定OD值。

2 實驗結果

2.1 重組質粒的構建

重組質粒pPIC9k-G4-HV1的酶切結果(圖1)和寶生物(大連)有限公司序列測定結果表明，所構建的質粒的序列與設計的序列完全一致，因此成功構建了pPIC9k-G4-HV1表達質粒。由于質粒pPIC9k上有2個Xho I的酶切位點，所以需先將目的基因轉入質粒pPIC9中，然后再經過Sac I和Sal I雙酶切轉入pPIC9k中。

圖1 pPIC9k-G4-HV1質粒雙酶切結果

2.2 重組轉化子的表達

搖床表達菌液取1 mL離心，留上清用TCA法沉淀做電泳分析(圖2)。電泳結果表明，成功表達出G4-HV1。挑取表達量相對較高的7號進行搖床培養表達。

圖2 搖床表達結果

2.3 純化

5 L表達菌液，離心收集上清，經疏水柱及反相C-18柱純化。將獲得的G4-HV1進行RPHPLC分析和質譜分析(LC/MSD SL質譜儀，Aglient Technologies公司出品)測定分子量，結果表明G4-HV1純度可達95%以上(圖3)。分子量測定結果與理論分子量一致。

圖3 RP-HPLC分析制備樣品結果

2.4 G4-HV1抗凝活性及可逆轉性測定

1)G4-HV1抗凝活性的測定。取G4-HV1，按比例稀釋，用TH法測定得到G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU(圖4)，WT-HV1的抗凝活性約為15 000 ATU(抗凝活性數據由重慶富進生物醫藥有限公司提供)。

圖4 TH法測定G4-HV1的抗凝活性

2)G4-HV1與凝血酶結合動力學。如圖5，經生色底物法測定后，比伐盧定100%可逆轉(與文獻報道相符)［11］，G4-HV1可逆轉性為 30% ～40%，而天然水蛭素完全不可逆轉。

圖5 TH法測定G4-HV1與凝血酶結合動力學

3 討論

經上游構建篩選、表達、純化和質譜鑒定得到了純度95%以上的G4-HV1，生色底物法測定G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU，與凝血酶結合動力學表明G4-HV1的可逆轉性為30%～40%。

G4-HV1的抗凝活性約為14 000 ATU，與水蛭素(約15 000 ATU)的活性基本無差異。本研究結果再次證明，水蛭素主要活性區域為N端球形區和C端纖維蛋白原結合區，指狀區域對活性幾無影響。但是將水蛭素的第45位至48位氨基酸替換為 Phe-Pro-Arg-Pro后，G4-HV1的可逆轉性為30%～40%，未出現比伐盧定樣100%可逆轉性。初步推測可能有2個原因:①水蛭素N端是由40多個氨基酸組成的球狀致密結構，使其與凝血酶結合更緊密，雖然中間的指狀區域被替換，但是由于空間位阻的影響，凝血酶的酶切的效率較低，從而G4-HV1的可逆轉只有30% ～40%;② 由于比伐盧定N端第1個氨基酸為D型，有研究［12］表明，比伐盧定N端的D型氨基酸有助其被凝血酶水解，而通過酵母表達的則為L型，所以G4-HV1的可逆轉相對比伐盧定低。

本文所研究的G4-HV1可逆轉性相對較低，下一步將通過分子模擬結合實驗，將G4-HV1第41位至44位或第49位至52位的氨基酸改為柔性較強的甘氨酸，使指狀區域暴露更充分，更利于凝血酶酶切，使可逆轉水蛭素活性喪失更迅速，凝血酶活性恢復更快，進一步提高可逆轉水蛭素的可逆轉性。

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