苯酚在實驗紅鯽C1HD系體內富集的實驗研究

董先輝，張朝暉，梁世杰，高麗君，朱曉娟，吳端生

1.南華大學藥學與生命科學學院，湖南衡陽 421001

2.南華大學公共衛生學院，湖南衡陽 421001

苯酚是重要的有機化工原料，用它可制取酚醛樹脂、己內酰胺、雙酚A、水楊酸、苦味酸、五氯酚、2，4-D、己二酸、酚酞n-乙酰乙氧基苯胺等化工產品及中間體，在化工原料、烷基酚、合成纖維、塑料、合成橡膠、醫藥、農藥、香料、染料、涂料和煉油等工業中有著重要用途[1]。

在中國苯酚作為產品或中間產物的大量使用，使其成為地表水中的第一大類水體污染物，對水生生態環境存在一定的生態風險[2]。苯酚屬細胞原漿型毒物，低質量濃度下可使蛋白質變性，高質量濃度時使蛋白質凝固，為神經性毒劑。水體環境中的苯酚對水生生物尤其是魚類危害嚴重，不僅可造成魚蝦發生急性中毒死亡，而且易在水生生物體內富集影響水產品的品質[3]，富集的苯酚隨食物鏈遷移將存在危害人體健康的風險。為了尋找檢測水環境毒物毒性水平的新方法，探討實驗紅鯽作為模式動物用于水環境污染物檢測和化學品毒性試驗的可行性，本文觀察了苯酚在實驗紅鯽C1HD系體內的富集和解富集過程。

1 試驗材料及儀器

1.1 苯酚

苯酚（C6H6O，phenol）又名石碳酸，羥基苯，分子式為C6H5OH，呈弱酸性，熔點為43℃，沸點為181.9℃，相對密度為1.0576，常溫下微溶于水，易溶于有機溶劑，腐蝕性極強，在空氣中易被氧化而常呈粉紅色[4]；本實驗用分析純苯酚購于湖南匯虹試劑有限公司。

1.2 其他藥品或試劑

三氯甲烷、氯化銨、氨水，分析純，均購于湖南匯虹試劑有限公司；4-氨基安替比林，分析純，購于天津市光復精細化工研究所；鐵氰化鉀，分析純，購于長沙市分路口試劑化工廠。

1.3 主要儀器

250ml分液漏斗，功率可調電熱爐。250ml全玻璃蒸餾器，紫外可見分光光度計（SHIMADZU UV2450），10mm光程比色皿。

1.4 實驗動物

實驗紅鯽C1HD系，為本實驗室培育并提供。

2 方法

2.1 實驗紅鯽飼養方法

試驗用水為曝氣3d的自來水pH值6.54、溶氧量6.21mg/L、水溫（20±4）℃。水中不含苯酚。試驗用魚為馴養2周以上，7d內死亡率為0%。采用半靜態式飼養方式，每天定時換入一半體積新鮮飼養用水。清除階段將在吸收試驗所用紅鯽放置在無酚水中繼續飼養。空白對照組，一直飼養在無酚水中。試驗期間不進行喂食及增氧泵增氧。每天定時測定飼養環境溫度、pH值及溶氧量等參數。每隔四天從各濃度組平衡樣中隨機抽取2尾摘取內臟組織，用于分析。

2.2 96h LC50測定及試驗濃度分組

96hLC50試驗方法參考文獻[5]。根據96 h LC50設置LC50/10、LC50/100兩個苯酚濃度組及空白對照組，各濃度組設置兩個平行樣。

2.3 苯酚的提取及濃度測定

解剖紅鯽摘取內臟，無酚水清洗去除雜質，濾紙擦干后稱重，勻漿器混合研磨內臟組織（腸、心、肝胰臟等）至勻漿狀態，無酚水定容至100mL。水中苯酚提取及測定參考中華人民共和國國標GB7490-87：水質揮發酚的測定采用蒸餾后4-氨基安替比林分光光度法[6,7]。

2.4 統計學分析

數據用平均數±標準差表示，分組之間用t檢驗。

3 結果

3.1 苯酚對紅鯽的96 h LC50

實驗得到各苯酚濃度組紅鯽致死情況如表1所示。直線內插法求得96hLC50為37.02mg/L。以此設置兩個實驗濃度組LC50/1000.3702mg/L和LC50/103.702mg/L。

表1 紅鯽96 h死亡情況

3.2 苯酚在紅鯽體內的富集含量

苯酚在紅鯽體內的富集動態變化見表2。32d時LC50/100和LC50/10濃度組富集穩定態苯酚含量分別為0.7998±0.0088mg/g，1.4095±0.0039mg/g。LC50/100濃度組要比LC50/10提前進入富集穩定態。LC50/100和LC50/10濃度組苯酚吸收速率常數K1分別為0.03333mg/gd，0.04405mg/gd。富集達到穩定態一半濃度需要時間分別為11.39d，10.71d。經t檢驗試驗期最終穩定態含量,兩組內臟組織苯酚含量差異顯著(P＜0.05)，這表明內臟組織內苯酚含量隨水中濃度升高而升高。

表2 苯酚在紅鯽內臟組織的積累（X±SD）

BCFss穩定態生物富集系數(steaty state bioconcentration factor)=單位質量組織含酚量/水酚濃度；T:富集至穩定態受試物含量50%所用時間；K1=吸收速率常數(uptake rate constant)。

3.3 苯酚從紅鯽體內的解富集過程

苯酚的解富集動態變化如表3所示。按Renfro（1973）方法[9]得LC50/100和LC50/10濃度組內臟組織內苯酚24d的殘留量分別為23.13%，13.57%；釋放率分別為76.87%，86.43%；解富集生物半衰期分別為：10.72d，10.14d；清除速率系數K2分別為：0.02851mg/gd，0.05638mg/gd。

表3 苯酚在紅鯽內臟組織的解富集（X±SD）

4 討論

近年來，國內外關于酚類物質對于魚類急性毒性作用及分子毒理學方面的研究有較多的報道，但較少有酚類物質在魚類體內富集的實驗研究的報道。1977年湖北長江水產研究所做過酚在魚體內積聚及消除的研究[10]及2001年魏愛泓等研究過鯉對酚的積累、分配和釋放[3]。后者設置0.005mg/L，0.025mg/L，0.05mg/L3個濃度組，分別對應的在肌肉組織內的富集濃度為0.3982±0.063mg/kg，0.7531±0.081mg/kg，1.0921±0.39mg/kg， 與本實驗結果相差較大,主要在于不同的處理濃度。這也說明在魚體內的最終富集含量與魚生存的水環境苯酚的濃度直接相關,水環境中苯酚含量越高最終富集穩定態苯酚含量越高。根據魏愛泓的研究，在解富集的過程，生物半衰期隨著水環境苯酚濃度的增加逐漸延長，分別為5.52d，8.03d，13.90d，比較本實驗的高濃度組為10.14d和低濃度組為10.72d，也相差較大，分析原因可能是魚體內不同組織解富集的方式有很大的區別，且與富集含量相關性較高。一方面，內臟組織的解富集在本實驗設置的濃度范圍內生物半衰期相差不大，這可能是由于內臟組織代謝較旺盛且與水環境更加貼近從而更利于富集化學品的清除，至于在更寬的濃度范圍是否生物半衰期有所改變，還需要進一步實驗驗證；另一方面，內臟組織生物半衰期相比較肌肉組織較長，分析可能是在較高富集含量時，魚自身防御能力提高新陳代謝，致使清除苯酚能力提高，降低了生物半衰期，即在一定范圍內生物半衰期隨苯酚富集含量的提高會有所降低。

全球苯酚需求的年均增長率將達到4%～5%，2006年苯酚需求量就達到了800萬t。2004年，我國苯酚生產能力為74.0萬t/a，產量約41.0萬t，近年國內苯酚消費量以每年約9%的速度在遞增[11]。本文通過探討不同濃度苯酚在紅鯽C1HD系體內的富集、解富集的規律，得出苯酚在魚體內的動態富集穩定態含量、富集系數，解富集殘留量，釋放率及生物半衰期等參數，這將為漁業水質監測及水產品質量保證提供了參考數據。

水生動物中魚類具有某些獨特的生物學特性，可以用于胚胎學、遺傳學等基礎醫學以及實驗動物醫學，比較醫學，環境毒理學，化學品毒性檢測等應用性研究[12]。作為實驗魚類，國外已有斑馬魚（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）等10余種。我國還沒有本土標準化的實驗魚類正式注冊。目前已培育出“準”標準化的實驗魚類僅僅只有中國水產科學院珠江水產所培育的實驗劍尾魚（Xiphophorus helleri）、中國科學院水生生物研究所培育的稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）和本實驗室培育的實驗紅鯽（Carassius auratus red variety）。紅鯽C1HD系用于環境毒理學研究，一方面，其體型比國際通用實驗斑馬魚較大而更有利于富集含量較低，污染物濃度較低或檢測限較高化學品的檢測；另一方面，其生長生存能力較強，更利于毒性較強化學品或污染程度較高水域毒性研究。這些獨特的優勢表明實驗紅鯽是一種很有開發價值的毒理學實驗動物。

[1]國家環境保護總局:水和廢水監測分析方法.北京：中國環境科學出版社，2002：725-729.

[2]Qu J, Fan M: The current state of water qua1ity and techno1ogy deve1opment for water po11ution contro1 in China.Critica1 Reviews in Environmenta1 Science and Techno1ogy，2010，40(6)：519-560.

[3]魏愛泓，徐虹，朱毅.鯉對酚的積累、分配和釋放研究.水產科學，2001，20(1)：12-14.

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[6]國家環境保護總局: 水質揮發酚的測定，蒸餾后4-氨基安替比林分光光度法.中華人民共和國國標GB7490-87，1987：130-137.

[7]Zhang PP, Shi ZG, Feng YQ: Determination of pheno1s in environmenta1 water samp1es by twostep 1iquid-phase microextraction coup1ed with high performance 1iquid chromatography.Ta1anta，2011，85(5)：2581-2586.

[8]國家質量監督檢驗檢疫總局：化學品 生物富集 半靜態式魚類試驗. 中華人民共和國國家標準GB/T 21858-2008，2008.

[9]Renfro: Radio cadmiam exchange with seawater by fundu1us betero c1itus.J.Fish Bio1，1974，6，6：601-612.

[10]湖北省長江水產研究所資源捕撈室污水研究組：酚在魚體內積聚及消除的研究.環境科學，1977(4)：41-43+64.

[11]焦鳳茹，龐振濤.苯酚國內外市場分析.化工技術經濟，2005(9)：21-24.

[12]江千秋，劉冬娥，田智，吳端生.魚類實驗動物的生物學特性及應用.湖南環境生物職業技術學院學報，2006(2)：129-132.