呼和浩特地區奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及其致病性與藥敏試驗

巴開明 李曉艷 內蒙古呼和浩特市動物疫病防控中心 010020

奶牛乳房炎是困擾奶牛養殖業的四大疾病之一，由于飼養環境和管理水平的不同，導致其病原菌的多樣性和地區性差異。2011年7月至8月間，我們對呼市地區部分奶牛場乳樣的病原菌進行分離鑒定，并對其致病性和藥物敏感性進行研究，以期對臨床合理治療乳房炎提供科學依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

（1）待檢材料

待檢乳樣主要采自呼和浩特市地區3個旗（縣、區）的5個大中型奶牛場（養殖小區），每個奶牛場每次隨機采取為無臨床癥狀或癥狀不明顯的10-15頭奶牛乳汁，共采集64頭奶牛256份乳樣。

（2）培養基

普通瓊脂培養基、鮮羊血瓊脂培養基和血清肉湯培養基，按參考文獻[1]介紹的方法自行配制；麥康凱瓊脂，廣東環凱微生物科技有限公司生產（批號：201001123），按產品說明介紹方法進行配制；各種微量生化培養基，杭州天和微生物試劑有限公司生產（批號：100223）。

1.2 試驗方法

（1）采樣方法

先用溫水，再用0.2%新潔爾滅擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳頭。采樣者同時進行手指擦拭消毒。每個乳室先擠去頭2～3把奶，以排除污染的雜菌，每頭奶牛取乳樣5～10mL.置于無菌試管中。采樣后立即送實驗室檢驗。

（2）病原菌的分離培養

（A）細菌分離培養

將新鮮采集的乳樣搖勻，分別取適量接種于營養肉湯（10%血清）、普通瓊脂培養基、鮮血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基（平板）后，置于37℃溫箱培養24～48h。觀察每個平板中細菌生長的情況，對菌落進行涂片染色鏡檢，觀察細菌形態特征和染色特性，挑取單個可疑菌落分別接種相應培養基進行純分離。

（B）生化鑒定

將上述純分離的細菌分別進行涂片染色鏡檢，檢驗其純度，然后將純分離的細菌根據其疑似特征分別進行糖類分解試驗、枸櫞酸鹽利用試驗M.R和V-P試驗、尿素試驗、觸酶試驗、血漿凝固酶試驗、CAMP試驗、馬尿酸鹽水解試驗、吲哚(靛基質）試驗進行生化鑒定。

（C）動物致病性試驗

取不同地區分離到主要細菌金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌各5株，用細菌的37℃、24h肉湯培養物，分別進行小白鼠腹腔注射，劑量為0.2mL/只的每種細菌注射4只，同時用生理鹽水對照。觀察24h內的發病死亡情況，對死亡或發病明顯者立即進行剖檢，取發病小白鼠的心、肝組織涂片、鏡檢，若與注入細菌相同，則判定此菌為病原菌。未死亡的繼續觀察1周后剖解，觀察其變化。

（D）藥物敏感性試驗

[2]介紹的圓紙片擴散法進行，即用吸管滴加純培養菌液0.1-0.2mL于鮮血瓊脂平板上，用L棒將菌液均勻涂布，加蓋后放置10min左右，待平板面稍干，用鑷子將藥敏紙片平放在瓊脂平板上，并輕壓使其緊貼平板表面，藥敏紙片一旦接觸平板即不再移動。用直徑為90mm的平皿，可貼紙片5張，兩紙片中心距離不少于24mm，紙片與平皿邊緣不少于15mm。貼好紙片的平板，置37℃培養24h，觀察結果，測量抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑)，計算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑。判定標準：抑菌圈直徑在20mm以上為極敏感，直徑在15-20mm為高度敏感，直徑10-15mm為中度敏感，直徑在10mm以下為低度敏感，無抑菌圈為不敏感。

2 試驗結果

2.1 細菌的分離結果

對64頭奶牛的256份乳樣隨機取樣64份進行細菌的分離鑒定，從61份乳樣中檢出10種菌共98株，陽性率是 95.31%（61/64）。24份隱性乳房炎乳樣中24份陽性，陽性率100%（24/24），混合感染型14份，混合感染率是58.33%；8份臨床型乳腺炎乳樣中8份陽性，陽性率100%，混合感染型4份，混合感染率是50.00%。64份乳樣中混合感染率共占28.13%（18/64），混合感染菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌、鏈球菌，其中混合感染中優勢菌株是大腸桿菌。隱性乳房炎的主要病原菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌，臨床型乳房炎的主要病原菌是停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、變性桿菌。各地檢出菌結果見表1。

表1：各旗(縣、區)檢出細菌結果 單位:株

2.2 動物致病性試驗結果

注射5株金黃色葡萄球菌的小白鼠有10只死亡，并從死亡小白鼠肝臟中分離到金黃色葡萄球菌，其余沒有死亡小白鼠有不同程度的臨床反應，例如，精神沉郁、采食量下降、被毛蓬亂等。注射鏈球菌的小白鼠組未出現死亡，可見小白鼠精神沉郁、畏寒、被毛蓬亂、飲食減少或停止，2天后恢復正常，第3天處死解剖見腹腔內有大小不等的膿包，并從膿包中均分離到了鏈球菌。注射大腸桿菌組小白鼠有4只死亡，其余均有不同程度的臨床反應。注射克雷伯氏菌組的小白鼠未出現死亡，只有不同程度的臨床反應。而注射變形桿菌組的小白鼠只出現了比較輕微的臨床反應，很快就恢復正常。

2.3 部分分離菌藥敏試驗結果

本試驗分離的5種15株細菌藥敏試驗結果見表2。

表2：部分分離菌藥敏試驗結果 單位：mm

由表2可以看出，臨床上常用的20種抗菌藥物，不同養殖場分離的細菌對20種藥物的敏感性差異極大，有的場對大部分藥物都敏感，而有的場只對部分藥物敏感，而從兩個不同場分離的克雷伯氏菌對20種藥物均高度敏感。不同致病菌對不同抗菌藥產生了不同程度耐藥性，其他所有致病菌對青霉素均耐藥。結果提示，治療奶牛乳房炎最好的辦法是各地找準主要致病菌，通過藥敏試驗找出敏感藥物治療乳房炎，避免濫用抗菌藥，提高乳房炎的治愈效果。

3 討論與小結

本試驗從64頭奶牛的256份乳樣隨機取樣64份進行細菌分離鑒定，從61份乳樣中檢出10種菌共98株，陽性率是 95.31%（61/64）。說明各奶牛養殖場在夏季細菌感染是造成奶牛乳房炎的主要因素。分析其原因，可能與呼和浩特地區夏季氣溫比較高且多雨，各種致病菌大量滋生，再加上各場對消毒措施不夠嚴格有著密切的關系。另外，雖然細菌分離率比較高，但不是能分離到細菌就一定是乳房炎的患牛，有些正常牛也可在其乳中分離到細菌的。同時，乳中細菌分離率比較高也說明這些養殖場環境中細菌污染比較嚴重。

一般認為，引起奶牛乳房炎的細菌主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌等，而本次試驗中在一個地區的兩個養殖場分離到了3株沙門氏菌，而且均是混合感染有其它致病菌，結果表明，在一些地區沙門氏菌也是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，在防治中也應給以高度重視。從我們對呼和浩特地區奶牛乳房炎患牛細菌分離結果來看，引起本地區奶牛乳房炎的主要致病菌為停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌等。這與其他類似研究所報道的結果是一致的。

從動物試驗的結果中可看出，雖然多數細菌可引起小白鼠的臨床反應，但致死率比較低，說明多數引起奶牛乳房炎的病原菌的致病力不強，但這些細菌在乳房內繁殖和產生的毒素、代謝產物等可造成乳房出現炎癥。

藥敏實驗結果表明,各養殖場分離菌對試驗中所使用的20種抗菌藥物的敏感性差異極大，有些場的分離的菌對試驗中絕大多數藥物敏感，而有的養殖場的分離菌只對極少數藥物敏感，這可能是這些養殖場的奶牛多是從不同地區的散戶收購來的，散戶自己在平時的治療中使用過多種抗生素，使細菌產生了結構、生理及生化功能的改變，它們對各種藥物的敏感性降低或消失，因此產生了耐藥性。而養殖場的奶牛在集中飼養后，由于不注意消毒，造成了奶牛的交叉感染，使得在發病后的治療中效果不理想。所以在藥物的選擇上，建議各養殖場在治療時最好選用兩種或兩種以上的敏感藥物交替使用，以防止抗藥菌的產生。從我們對不同地區不同養殖場的部分分離菌的藥敏試驗結果可看出，這些分離菌對頭孢噻吩、氧氟沙星、環丙沙星、頭孢曲松、恩諾沙星高度敏感。因此，建議呼和浩特地區各養殖場在今后的奶牛乳房炎防治中可采用上述敏感藥物進行治療。對那些產生嚴重耐藥性的養殖場治療時最好對發病奶牛進行病原分離，并進行藥敏試驗，統計本場的病原種類和耐藥性情況，這樣治療效果才會比較理想。

參考文獻：

[1]陳天壽主編，微生物培養基的制造與應用[M].北京：中國農業出版社，1993

[2]鄧旭明.獸醫藥理學[M].北京:中國農業出版社，2001