原料奶中抗生素殘留及快速檢測方法

張彩紅 索 寶 李正洪 李兆林 陳麗娜 內蒙古奶聯科技有限公司

引言：牛奶與人們的生活息息相關。牛奶中抗生素殘留問題受到各國政府和食品安全機構的廣泛關注。為了保障人們飲用牛奶的衛生和安全，對牛奶中抗生素殘留檢測技術的研究得到發展，并且正在尋求簡便、快速、準確和敏感性高的檢測方法，以滿足日趨嚴格的殘留限量的要求。抗生素作為動物藥物和飼料添加劑被廣泛應用，必然會造成抗生素在動物性食品內的殘留，特別是牛奶中抗生素的殘留已引起消費者的重視。美國、歐盟和日本等世界許多國家已經要求對原料奶的抗生素實行強制性檢測，歐盟已對最大殘留量(MRL)作了詳細的規定，MRL為4μg/kg[2]。因此，只有不斷發展快速、準確、靈敏度高的檢測方法,才能滿足日趨嚴格的殘留限量的要求，保障牛奶的食用安全。

1 牛奶中抗生素殘留的來源

一般認為，對泌乳牛用藥不當或不注意休藥期是牛乳中抗生素殘留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素的殘留。在奶牛飼料中添加飼料添加劑已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是預防疾病，這是牛奶抗生素殘留的重要原因。1983年，Egan調查表明，用經抗生素治療的乳牛用過的擠乳器給正常乳牛擠乳，可使正常牛的乳中殘留抗生素，所以擠乳是乳中抗生素殘留的另一個原因[3]。此外，一些不法交奶戶在高溫季節為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，這也是乳中抗生素殘留的一個來源。

2 原料奶中抗生素殘留的危害

抗生素在畜牧業的廣泛應用 ,不可避免地造成牛乳中抗生素殘留。一般的抗生素對熱的穩定性高,牛奶加熱殺菌無法將其破壞,所以混有抗生素的牛奶加工成奶制品后仍有大量的抗生素殘留,如果經常飲用此種牛奶,將反復受到抗生素的刺激而發生致敏。原料乳中抗生素殘留物不僅影響乳制品加工 （如嚴重干擾發酵乳制品的生產，影響干酪、黃油、發酵乳的起酵和后期風味的形成），而且長期服用含低劑量抗生素殘留的乳制品就相當于經常低劑量服用抗生素，會導致人體耐藥性增加和免疫力下降，部分有過敏體質的人還可能出現蕁麻疹、發熱甚至過敏性休克，危害人體健康[4]。完成對奶源的有效管理，這種管理概念不僅在目前中國奶源不足、飼養分散、管理困難情況下是最好最有效的管理模式，也是今后中國實行大規模集中飼養管理的必然趨勢和基礎。

3 原料奶中抗生素殘留的現狀

從全國不同城市近幾年的調查情況來看，不管是城市售鮮奶還是巴氏消毒奶，抗生素殘留奶較為嚴重。從超標的情況看，超標率達10%以上的藥物有10種，超標率達20%以上的藥物有8種。牛奶中殘留的抗生素主要為青霉素類藥物和磺胺類藥物，其中CEPA和PEN-V殘留最為嚴重，檢出率達35%以上。其次是A肝、PEN-G、CIF、SD和SMZ，檢出率達20%以上。牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視。我國過去對牛奶中抗生素殘留衛生指標無明文規定，直到2001年10月，農業部發布實施了《無公害食品生鮮牛乳行業標準》，對新鮮牛乳的衛生指標明確了＂抗生素不得檢出＂。但對這一行業標準，我國目前并未能嚴格執行，致使牛奶及奶制品中抗生素殘留問題一直未能得到解決，以至引起了人們對牛奶安全問題的擔憂，并成為越來越受關注的焦點。

從以上情況可以看出，我國牛奶中抗生素殘留現狀并不令人樂觀，有關部門應加強對牛奶生產的管理，并對牛奶中的抗生素等藥物殘留進行有效檢測和監控，以保證人們飲用牛奶的衛生和安全。

4 原料奶中抗生素的分類

抗生素的種類已達幾千種。在臨床上常用的抗生素有幾百種，它們主要分為β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、大環內酯類和磺胺類。在發達國家牛奶中抗生素的殘留問題早就受到重視。聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）早在1969年就提出了應對各種動物性食品中的抗生素殘留的允許標準。美國食品藥物管理局（FDA）規定牛奶中抗生素殘留量不得超過0.006國際單位/ml，超過允許量標準的牛乳及其乳制品全部做廢棄處理，其中要求A級巴氏原料奶中沒有抗生素殘留，且對原料奶的抗生素檢測為強制性[5]。

5 原料奶中抗生素的控制措施

目前，減少和避免原料奶中抗生素殘留應采取以下措施：一是在獸醫的指導下合理用藥，不能將抗生素的使用作為預防疾病的唯一措施；二是使用合格的飼料產品，避免在不知情的情況下使用含有抗生素的產品；三是用藥后嚴格執行停藥期；四是加強飼養管理，將患病奶牛單獨隔離飼喂，擠奶器具不得混用，做到安全擠奶，同時要控制牛乳腺炎的發病幾率，減少抗生素的使用[6]。

6 原料奶中抗生素的檢測方法

在奶牛生長過程中，β-內酰胺、喹諾酮和大環內酯類抗生素經常被用于治療疾病。由于各種原因，造成其在動物的細胞、組織、器官或可食性產品(如蛋、奶)中的殘留，直接影響著人類的健康[7]。抗生素的分析方法主要有：微生物法、免疫學法和高效液相色譜法。微生物法和免疫學法由于成本低和省時等優點，被廣泛用于篩選實驗。高效液相色譜法主要用于確認實驗。

（1）微生物法

微生物檢測法是應用較廣泛的方法，其檢測原理是根據抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用,對樣品中抗生素殘留進行定性或定量檢測，如TTC 法（氯化三苯基四唑氮法）、BSDA法（嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法）、PD法 （紙片法）及 STOP法（拭子法）等[8]。其中，TTC 法是檢測牛奶中抗生素殘留的常用方法，也是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標準規定的檢測方法。其檢測費用低，但是檢測時間長，通過肉眼辨別檢測結果易產生誤差，且操作復雜、結果易受嗜熱鏈球菌數量和消毒劑影響和靈敏度較低。

（2）高效液相色譜法

高效液相色譜法簡單、快捷，幾乎可以檢測牛奶中所有的抗生素。2008年12月31日，我國發布了牛奶中一系列抗生素的檢測方法（GB/T 22975-2008）[9]，并于2009年5月1日正式實施，該標準規定了牛奶和奶粉中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、氯唑西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林和雙氯西林等抗生素殘留量的高效液相色譜-串聯質譜檢測法。高效液相色譜-串聯質譜法同時具有分離、定量和定性(分子結構信息)等功能，靈敏性較高，特別適用于精確測定，但是其檢測程序復雜，檢測費用高，因此一般用于大型實驗室。

此外，隨著接口技術的顯著改進，質譜作為一種質量流速型檢測器，正廣泛應用于殘留分析的檢測中。電化學檢測器也已用于檢測鄰氯青霉素、頭孢菌素和青霉素[10]。與常規的理化分析技術相比，免疫分析技術最突出的優點是操作簡單，速度快、分析成本低。

（3）免疫分析法

目前，牧場規模擴大，對原料奶中抗生素的檢測要求嚴格，國內引進了美國 CHARM 公司的先進技術。將RIA（放射免疫檢測）技術、ELISA（酶聯合反應）技術、生物發光技術、液體閃爍技術融為一體，推出用于快速檢測食品中抗生素殘留和黃曲霉毒素的CHARM II系統，使食品快速檢測方法發生重大飛躍。CHARM II是以ELISA技術為基礎，故某抗體只能特異性結合某類抗生素，即使樣品中存在其它抗生素也不會產生干擾，并且抗體可識別同類抗生素的共同結構--母環，因此幾乎可以檢測β-內酰胺類、磺胺類、四環素、大環內酯類、氯霉素、氨基糖苷類、新生霉素、壯觀霉素等多種抗生素以及黃曲霉毒素。CHARM II無需樣品處理，8分鐘即可得到檢測結果，并且檢測限符合歐盟、美國和中國的限量要求。

檢測原理：CHARM ROSA抗生素殘留快速檢測儀包括抗生素檢測條、孵育器和讀數儀，主要根據競爭性受體-配體免疫反應進行檢測 （受體是細胞在進化過程中形成的細胞蛋白組分，能識別周圍環境中某種微量化學物質；配體是能與受體特異性結合的物質）。檢測條具有兩條俘獲帶，其中一條為檢測帶（T，由配體組成），另一條為控制帶（C）。當樣品與被標記的受體混合后，受體將在俘獲帶上被俘獲，并顯出紅色,我們可以通過反應后俘獲帶顏色的深淺來判定結果。

檢測方法：開啟孵育器電源，待溫度達到56℃時，開啟讀數儀，調整至相應頻道，并取出待測原料奶樣品并搖勻；然后用移液器將300μL牛奶樣品豎直滴加至檢測條兩側任意一側的凹槽中，蓋上孵育器塑料蓋，8分鐘后，蜂鳴器響動，打開塑料蓋，取出檢測條，目視或通過讀數儀判讀結果（操作步驟見圖1）。

將測試條放至加熱器凹槽，撕開試劑條的不干膠至紅色線

將樣品搖勻，用移液槍加入300μl奶樣，蓋上蓋，56℃培育8分鐘（氯霉素40℃）

將檢測條標有＂C＂的一端插入讀數儀，按ENTER進行檢測。目測判讀結果

β-內酰胺四環素類檢測條：有兩條檢測線，BL線為β-內酰胺類檢測線，TE線為四環素檢測線，若兩條檢測線中有一條或者兩條顏色均淺于質控線，或檢測線未出現，則說明結果為陽性；若檢測線顏色與質控線相當或深于質控線，則說明結果為陰性。

B∶Charm Rosa讀數儀判讀結果陰性質控的結果應為 Result：Negative，READING 小于-400。 （磺胺、鏈霉素小于-600），陽性質控的結果應為Result：Positive，READING 大于+400[11]。

免疫分析法是以抗原或半抗原與抗體特異性結合為抗原抗體復合物的免疫反應為基礎的生化測試技術。免疫分析法主要包括放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、熒光免疫分析法(FIA)和酶聯免疫吸附法(ELISA)。與常規的理化分析技術相比，免疫分析技術具有操作簡單、速度快、分析成本低等優點。

結束語

綜上所述，鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題，原料奶的安全問題是國內乳品行業面臨的共同難題，其中藥物殘留，特別是抗生素殘留是原料奶中存在的安全問題之一。重視和加強檢測已成為工作的首要任務，并努力研究發展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術。免疫分析法不僅是牧場生產中檢測抗生素的首選方法，大型的乳品生產企業也在廣泛使用。

[1]劉瑛，魏清芳.原料奶中抗生素殘留及危害.農產品加工（學刊）,2005年11期.

[2]曹亢,曹雪,任發政.牛奶中抗生素殘留機器檢測方法研究進展.中國乳業,2009年第09期.

[3]吳瑕,張蘭威.原料奶中抗生素的來源.食品與發酵工業,2004年07期.

[4]趙少華.食品(乳品)中存在抗生素殘留的風險及其控制[J].中國食品工業,2008年11期.

[5]呂文東,張春華,韓秋紅，劉玲.原料奶中抗生素的分類.中國乳品工業,2005年08期.

[6]劉亞男.原料奶中抗生素的防控措施.北方牧業，2011年14期.

[7]馬兆瑞,祝戰斌,卡爾·萊金特.乳和乳制品中殘留抗生素的檢測方法[J].中國乳品工業,2003年04期.

[8]]GB/T4789.27-2008.

[9]抗生素的檢測方法（GB/T 22975-2008）.

[10]黎源倩，張禮春.超高效液相色譜同時測定奶粉和牛奶中β-內酰胺、喹諾酮和大環內酯類抗生素的殘留（分析實驗室）.

[11]卜慶倩.北京博歐實德生物技術.