超能聚焦超聲栓塞兔VX2腫瘤血管的實(shí)驗(yàn)研究

蘇 靜，劉麗萍，陳文直

(解放軍第152中心醫(yī)院，河南 平頂山 467000)

實(shí)體瘤生長(zhǎng)至直徑達(dá)1～2 mm時(shí)即開(kāi)始血管化，隨后腫瘤增生和轉(zhuǎn)移加快，可見(jiàn)，血管在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的多步驟過(guò)程中，均發(fā)揮重要作用，阻斷腫瘤血管使腫瘤生長(zhǎng)延緩甚至消失［1－2］。抑制腫瘤血管再生，破壞腫瘤血管已成為腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。超能聚焦超聲(HIFU)作為一種非侵入性腫瘤治療的新方法，隨著其在臨床各種良、惡性實(shí)體瘤治療中的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其使腫瘤凝固性壞死的同時(shí)也破壞腫瘤內(nèi)的微血管、小血管［3］。本實(shí)驗(yàn)從彩色多普勒血流成像(CDFI)、數(shù)字減影血管造影(DSA)等方面定性探討HIFU栓塞腫瘤血管的可行性及安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純種健康新西蘭大白兔56只，雌雄不限，2～3 月齡，體質(zhì)量 1.5 ～2.0 kg(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。荷瘤種兔2只(重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超聲工程研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥品及設(shè)備 速眠新、蘇醒靈－Ⅲ號(hào)(解放軍農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所);質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%硫化鈉(上海化學(xué)試劑總廠);JC型聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)(重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超聲工程研究所)，治療頭頻率0.4 MHz;Volu-son730 Expert超聲診斷儀(德國(guó)GE公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用隧道組織塊包埋法［4］將兔VX2腫瘤組織塊接種于兔大腿股外側(cè)肌肉內(nèi)，建立兔VX2肌肉腫瘤模型，接種后2周將56只腫瘤模型兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(A組)、實(shí)驗(yàn)組(B組、C組、D組)4組，每組14只，分別給予HIFU假照和聲強(qiáng)分別為1194、1592、1990 W·cm－2的 HIFU 輻照。HIFU輻照采用3D分層點(diǎn)輻照，完全覆蓋腫瘤，假照組與實(shí)驗(yàn)組不同之處在于未開(kāi)啟功率源。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 CDFI檢查 每組分別于HIFU輻照前及輻照后第3、7天行CDFI檢查，每次選擇血流顯示最多的切面記錄，儀器各項(xiàng)設(shè)置參數(shù)均相同，且該操作由專業(yè)超聲科醫(yī)生完成。對(duì)切面血管數(shù)目(點(diǎn)狀、條狀、長(zhǎng)條狀均按1條血管計(jì)算)做半定量分析。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí)，瘤體內(nèi)無(wú)血流信號(hào);1級(jí)，瘤體內(nèi)血管少于3條;2級(jí)，瘤體內(nèi)血管 3～5條;3級(jí)，瘤體內(nèi)血管超過(guò)5 條［5］。

1.4.2 DSA檢查 每組分別于 HIFU輻照后第3、7天行DSA檢查，DSA檢查過(guò)程:于檢查前將兔腹部用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硫化鈉脫毛、備皮，麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)，消毒，依次切開(kāi)腹部皮膚、肌肉、腹膜，以紗布覆蓋膀胱、腸管，暴露腹膜下方的兔腹主動(dòng)脈，在髂總動(dòng)脈分叉處鈍性分離出動(dòng)脈后用絲線牽引其近心端，以頭皮靜脈針向離心方向穿刺進(jìn)入HIFU輻照側(cè)后肢股動(dòng)脈，成功后固定針頭于股動(dòng)脈內(nèi)，隨行DSA攝影檢查，所用造影劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%泛影葡胺，用量為3～4 mL，以1.0 ～ 1.2 mL·s－1的速度推完造影劑［6］。整個(gè)攝片過(guò)程請(qǐng)有豐富經(jīng)驗(yàn)的SA專家指導(dǎo)進(jìn)行。曝光條件自動(dòng)調(diào)節(jié)，分段曝光采像，圖像質(zhì)量按重點(diǎn)部位顯像情況滿足診斷要求程度和有無(wú)人工偽影等綜合診斷。

1.4.3 病理學(xué)檢查 HIFU輻照后第3、7天每組各取2只于腫瘤邊緣和正中取材，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色，光鏡觀察，以全面評(píng)價(jià)腫瘤血管分布情況及HIFU對(duì)腫瘤血管和周圍組織的損傷情況。

1.4.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 HIFU輻照后各組取材的同時(shí)，先迅速切取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織標(biāo)本放入4℃下保存的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液，用固定液沖洗組織表面的血液成分后，再用40倍于標(biāo)本體積的量加入新鮮固定液，4℃保存2 h;完成前固定的標(biāo)本再用 0.1 mol·L－1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2 ～7.4)于4℃下沖洗3次。經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%餓酸后固定2 h，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、修塊和制刀，CQR-1型超薄切片機(jī)制備成半薄切片。醋酸雙氧鈾和硝酸鉛染色后，在H-600透射電鏡下觀察并攝片、定性分析、觀察腫瘤血管以及周圍腫瘤實(shí)質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 CDFI檢查結(jié)果 各組HIFU輻照前，CDFI示腫瘤周邊半環(huán)狀或短棒狀血流信號(hào)，內(nèi)部零星狀血流信號(hào)，瘤體內(nèi)血管3級(jí)，腫瘤有豐富的血供。輻照后第3天，A組、B組和 C組較輻照前無(wú)明顯變化，D組(8/14)腫瘤周邊短線狀或星點(diǎn)狀血流信號(hào)，內(nèi)部無(wú)血流信號(hào)，瘤體內(nèi)血管2級(jí)，較輻照前血流信號(hào)減少。輻照后第7天，A組顯示腫瘤周邊血流半環(huán)狀或短棒狀血流信號(hào)，血流豐富，D組偶見(jiàn)點(diǎn)狀或無(wú)血流信號(hào)，瘤體內(nèi)血管0級(jí)。見(jiàn)圖1。

2.2 DSA檢查結(jié)果 DSA連續(xù)動(dòng)態(tài)顯像可完整顯示動(dòng)脈期、靜脈期、毛細(xì)血管期的形態(tài)表現(xiàn)，能較清楚顯示兔大腿肌肉腫瘤供血血管的分布和腫瘤染色。HIFU輻照后第3天，A組、B組、C組DSA顯示動(dòng)脈期可見(jiàn)腫瘤滋養(yǎng)血管源自股動(dòng)脈，增粗、扭曲、移位，進(jìn)入腫瘤后，發(fā)出多條細(xì)小分支，腫瘤血管叢的形態(tài)不規(guī)則，毛細(xì)血管期腫瘤典型濃染，而D組顯示以上征象減少，腫瘤邊緣染色淺;HIFU輻照后第7天，C組毛細(xì)血管期腫瘤邊緣染色稍淺，D組腫瘤染色征象幾乎完全消失。見(jiàn)圖2。

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果 HIFU輻照后第3天，A組、B組、C組病理學(xué)表現(xiàn)相似，HE染色光鏡下未見(jiàn)變化;D組可見(jiàn)間質(zhì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落、血栓形成，部分閉塞血管，腫瘤細(xì)胞輕度壞死。HIFU輻照后第7天，A組、B組腫瘤周邊取材，光鏡下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞及血管無(wú)改變，中心取材光鏡下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞核固縮、核碎裂核核溶解等壞死，呈不規(guī)則小片狀紅染;C組可見(jiàn)瘤體內(nèi)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹，管腔內(nèi)有較多紅細(xì)胞聚集，血管周圍腫瘤細(xì)胞水樣變性;D組光鏡下可見(jiàn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞溶解、血栓形成，完全閉塞血管，血管周圍腫瘤細(xì)胞呈核碎裂、核溶解壞死。見(jiàn)圖3。

圖3 D組病理學(xué)檢查結(jié)果

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 HIFU輻照后第3天，A組、B組、C組透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)示:腫瘤血管管壁完整，偶見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均無(wú)明顯改變，D組腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，核局部輕度溶解，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器腫脹、裂解，核異染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的空化泡。輻照后第7天，D組腫瘤血管輪廓尚存，而內(nèi)皮細(xì)胞斷裂、脫落、溶解，腫瘤細(xì)胞核碎裂。見(jiàn)圖4。

圖4 各組輻照后腫瘤血管細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

3 討論

腫瘤血管是腫瘤快速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的必要條件，阻斷或破壞腫瘤血管可能抑制腫瘤的增生、轉(zhuǎn)移。抗血管生成和血管靶向治療在臨床治療腫瘤中取得一定的效果，但是療效待進(jìn)一步證實(shí)，采用阻斷血供的方法，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的消退，但遠(yuǎn)期效果不理想。經(jīng)導(dǎo)管栓塞化療是目前應(yīng)用較多的一種阻斷血供的方法，但此方法會(huì)給患者帶來(lái)較嚴(yán)重的創(chuàng)傷，且栓塞劑會(huì)隨血流運(yùn)行或時(shí)間的延長(zhǎng)造成異位栓塞或減低療效。

Hynynen等［7］認(rèn)為HIFU對(duì)血管的作用及作用機(jī)制與血管管徑、血流速度和超聲特性(頻率、聲強(qiáng)、輻照時(shí)間)有關(guān)。Ishikawa等［8］和Denbow 等［9］分別采用頻率為3.2 MHz、1.7 MHz的 HIFU 輻照鼠股動(dòng)脈，使動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，血流完全阻斷，但血管周圍組織出現(xiàn)壞死，安全性不好。而采用頻率為0.4 MHz，焦域聲強(qiáng)為1990 W·cm－2HIFU輻照能使兔股動(dòng)脈栓塞，而血管周圍組織無(wú)壞死，該治療參數(shù)有效且安全。分析血栓形成的原因是HIFU輻照后，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)裸露，血小板與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)接觸黏附，同時(shí)裸露的膠原纖維激活Ⅷ因子以及損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放出組織因子，啟動(dòng)外源性和內(nèi)源性凝血途徑，從而導(dǎo)致血栓形成，而在兔股動(dòng)脈附近接種腫瘤建立動(dòng)物腫瘤模型，其腫瘤間質(zhì)血管是在周圍正常血管的基礎(chǔ)上延伸擴(kuò)展形成的，是供給腫瘤營(yíng)養(yǎng)的血管的終末分支，其與股動(dòng)脈相比具有如下特點(diǎn):1)血管扭曲擴(kuò)張，不規(guī)則分支，血管管徑小于股動(dòng)脈，其血管內(nèi)血流速度較低，血流形態(tài)不一;2)血管僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，無(wú)平滑肌和神經(jīng)末梢，血管收縮功能差，血管基底膜不完整，通透性增高，血管外周間隙增大，從理論上可以推測(cè)該參數(shù)的HIFU可以栓塞腫瘤血管，我們最終的研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，頻率 0.4 MHz，焦域聲強(qiáng)為1990 W·cm－2HIFU可誘導(dǎo)腫瘤血管栓塞，阻斷腫瘤血供，使腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩，且腫瘤周圍正常組織無(wú)壞死，安全性高，為臨床尋求一種新的非侵入性栓塞腫瘤血管無(wú)創(chuàng)治療或綜合治療良、惡性腫瘤提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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