魚藤素對肝癌細胞株SMMC-7721增殖抑制和凋亡誘導作用的研究

李爭光，吳 駿，吳昌平，蔣敬庭，魯 露，徐 斌，鄭 曉

(蘇州大學附屬第三醫院腫瘤中心，江蘇 常州 213003)

原發性肝癌在全球范圍內發病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第3位，嚴重威脅著人類的生命健康［1］。我國為肝癌高發區，每年肝癌死亡病例約占全球的50%。肝癌起病隱匿，許多患者就診時已是晚期，其生存期一般只有3～6個月。經過近幾十年的努力，肝癌的診療雖然取得了巨大的進步，但其總體療效仍不令人滿意，5 a生存率低于12%。魚藤素是一種天然的魚藤酮類化合物，在多種腫瘤細胞和動物模型中均證實具有較強的抗腫瘤及化療増敏作用，魚藤素在肝癌中的作用尚未見報道［2-5］。本研究觀測魚藤素對肝癌細胞株SMMC-7721的作用，并初步探索其作用機制，為魚藤素的進一步研究開發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 魚藤素、二甲亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、噻唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司，氟尿嘧啶購自天津金耀有限公司，RPMI-1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，抗總Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、GAPDH一抗購自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗中所用其他常規試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株SMMC-7721為本實驗室保藏并常規傳代培養，生長于含有體積分數10%滅活胎牛血清，青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 g·L-1)的RPMI-1640培養基中，于37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。細胞常規3～4 d傳代1次，所有實驗采用對數生長期細胞。所用魚藤素首先溶于DMSO作為儲備液，然后稀釋于RPMI-1640培養基中作為工作液，保證工作液DMSO質量分數小于0.1%。

1.2.2 MTT法測定細胞活力 取對數生長期細胞，常規胰酶消化成單個細胞懸液，每孔3～5×103細胞接種于96孔板，于培養箱內孵育過夜后，每孔加入含不同濃度魚藤素(0～100 μmol·L-1)的RPMI-1640繼續孵育24～72 h，孵育48 h之后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，繼續孵育4 h。棄去上清后，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩搖勻，用酶標儀于570 nm波長測定吸光度值。按照下列公式計算藥物對細胞的抑制率:抑制率(%)=［(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD］×100%。

1.2.3 細胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳 采用1 μmol·L-1魚藤素處理細胞48 h后收集5×106個細胞，PBS洗滌細胞3次，重懸于適量裂解液5 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、體積分數0.25%Nonidet P-40和1 mmol·L-1EDTA，加入無 DNA酶的 RNA酶 0.2 g·L-1，37℃水浴孵育1 h，再加入蛋白酶 K 0.3 g·L-1，37 ℃水浴孵育1 h，取20 μL 上清在質量分數1.5% 瓊脂糖凝膠，50 V電壓下電泳2 h后觀察DNA ladder的形成。

1.2.4 細胞形態學觀測 取對數生長期細胞，常規胰酶消化成單個細胞懸液，每孔1×104個細胞，接種于6孔板，于培養箱內孵育過夜。細胞貼壁后，如上以1 μmol·L-1魚藤素處理72 h，體積分數70%冷乙醇固定細胞后，以0.001 g·L-1的PI染色倒置熒光顯微鏡下觀察，同時未處理細胞為對照。

1.2.5 Western blot檢測蛋白水平 細胞如上以1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后，收集1×107個細胞，按說明書以蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用蛋白定量試劑盒定量，與5×樣品緩沖液混合，煮沸5 min。將樣品每泳道20 μg在質量分數12%SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳，然后將蛋白轉印至PVDF膜。用封閉緩沖液(質量分數5%脫脂奶粉，20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，體積分數 0.1%Tween-20，pH 7.6)封閉1 h后，加入所需一抗4℃孵育過夜。TBS/T洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，ECL法顯色并曝光。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計學分析，以ˉx±s表示計量數據，2組之間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 魚藤素抑制SMMC-7721細胞增殖 MTT實驗結果顯示(圖1)，魚藤素處理后可明顯抑制SMMC-7721細胞增殖，隨著魚藤素濃度的增加，其抑制作用隨之增強，提示其作用呈劑量依賴性。各劑量組與對照組相比，相對細胞增殖抑制率比較差異均有統計學意義(P均＜0.05)。隨魚藤素處理時間延長，其抑制作用隨之增強，以0.8 μmol·L-1魚藤素處理 24 、48、72 h，其抑制率分別為(21.4±6.5)%、(35.5±3.9)%、(41.9±2.2)%，可見其作用呈時間依賴性。

圖1 細胞活力分析結果

2.2 魚藤素誘導 SMMC-7721細胞凋亡2 μmol·L-1魚藤素處理48 h后收集細胞，行DNA瓊脂糖凝膠電泳，結果處理后由大約180～200 bp的DNA片段形成典型的DNA ladder，說明魚藤素誘導了SMMC-7721細胞凋亡(圖2)。形態學觀測所見進一步證實，與處理細胞相比，SMMC-7721細胞經1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后，細胞總數、增殖分裂細胞減少，凋亡細胞增多(圖3)。

2.3 魚藤素對Akt的影響 Western blot檢測結果示魚藤素處理前后t-Akt水平無明顯變化，但SMMC-7721細胞經1 μmol·L-1魚藤素處理72 h后p-Akt水平較處理前明顯降低(圖4)。提示魚藤素不影響Akt的水平，但明顯抑制其磷酸化水平，從而抑制其活性。

3 討論

肝癌與其他大多數惡性腫瘤一樣，其發生發展不僅與細胞增殖有關，亦與細胞凋亡有關，故尋找有效抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的藥物，一直腫瘤治療研究的熱點［6-8］。

魚藤素是一種天然魚藤酮類化合物，最初被用作殺蟲劑，但進一步的研究發現魚藤素對惡性腫瘤有較強的預防和治療作用。本研究選用SMMC-7721細胞作為實驗細胞，在體外觀察了魚藤素的抗腫瘤作用，結果證實魚藤素可抑制肝癌細胞的增殖，其作用呈時間和劑量依賴性。細胞形態學的改變、DNA瓊脂糖凝膠電泳梯形條帶的出現均表明魚藤素能誘導SMMC-7721細胞凋亡。魚藤素抗腫瘤的主要作用是通過下調Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信號轉導通路實現的［4］，本文結果再次證實了這一機制。PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞的生長、增殖、死亡、存活過程中發揮著重要作用，是潛在抗腫瘤治療靶點［9-11］。Akt活化后可以通過磷酸化作用調控下游靶蛋白 Bad、Caspase-9、NF-B、mTOR等，經多種途徑促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節因子［12］。魚藤素正是通過下調Akt的磷酸化水平抑制其活性，從而發揮作用的。

圖4 Western blot蛋白水平檢測結果

總之，魚藤素對SMMC-7721細胞有增殖抑制和凋亡誘導作用，其作用機制與Akt磷酸化水平下調，活性抑制有關，但其深入作用機制還有待進一步研究。

［1］El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］.Gastroenterology，2007 ，132(7):2557-2576.

［2］Bortul R，Tazzari PL，Billi AM，et al.Deguelin，A PI3K/AKT inhibitor，enhances chemosensitivity of leukaemia cells with an active PI3K/AKT pathway ［J］.Br J Haematol，2005，129(5):677-686.

［3］Chen Y，Wu Q，Cui GH，et al.Deguelin blocks cells survival signal pathways and induces apoptosis of HL-60 cells in vitro［J］.Int J Hematol，2009 ，89(5):618-623.

［4］Chun KH，Kosmeder JW，Sun S，et al.Effects of deguelin on the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and apoptosis in premalignant human bronchial epithelial cells ［J］.J Natl Cancer Inst，2003，95(4):291-302.

［5］Hecht SS.Deguelin as a chemopreventive agent in mouse lung tumorigenesis induced by tobacco smoke carcinogens［J］.J Natl Cancer Inst，2005 ，97(22):1634-1635.

［6］Pathak AK，Bhutani M，Nair AS，et al.Ursolic acid inhibits STAT3 activation pathway leading to suppression of proliferation and chemosensitization of human multiple myeloma cells［J］.Mol Cancer Res，2007，5(9):943-955.

［7］Schapher M，Wendler O，Gr?schl M.Salivary cytokines in cell proliferation and cancer［J］.Clin Chim Acta，2011，412(19-20):1740-1748.

［8］Wong RS.Apoptosis in cancer:from pathogenesis to treatment［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30:87.

［9］Fresno Vara JA，Casado E，de Castro J，et al.PI3K/Akt signalling pathway and cancer［J］.Cancer Treat Rev，2004，30(2):193-204.

［10］Lu Y，Wang H，Mills GB.Targeting PI3K-AKT pathway for cancer therapy［J］.Rev Clin Exp Hematol，2003 ，7(2):205-228.

［11］Mitsiades CS，Mitsiades N，Koutsilieris M.The Akt pathway:molecular targets for anti-cancer drug development［J］.Curr Cancer Drug Targets，2004，4(3):235-256.

［12］Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival［J］.J Cell Mol Med，2005，9(1):59-71.