烏司他丁對膿毒癥大鼠臟器保護的代謝組學研究

陳名智 林名瑞 肖雄箭 林建東

膿毒癥是ICU的常見病，病死率高，據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在ICU感染病人中，30.8%有嚴重的膿毒癥或膿毒癥休克，病死率可達38.96%[1]。因此早期有效的診斷加及時的干預顯得十分必要。膿毒癥是由微生物感染引起的炎癥性反應綜合征，其引起代謝物的變化特別是血液中不飽和脂肪酸的濃度改變對病程發(fā)展起著重要的作用[2-3]。

烏司他?。║linastatin,UTI）對膿毒癥大鼠的臟器的保護的研究并不少見，無論是從常規(guī)臨床生化指標，還是從基因水平上都有相應的研究，而在此方面代謝組學的研究尚未有相關的報道代謝組學作為繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學之后的一門新興學科，目前已廣泛應用于各種臨床疾病的研究，在臨床醫(yī)學領域具有廣泛的應用前景。

本實驗采用HPLC／MS對烏司他丁預處理的膿毒癥大鼠代謝物主要是不飽和脂肪酸進行定性和定量分析，試圖在代謝水平上對烏司他丁保護膿毒癥患者臟器發(fā)生機制做一些初步探討，同時HPLC/MS對膿毒癥的早期診斷也有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 動物模型制備與分組健康雄性Wistar大鼠30只[動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005]，體重（200±20）g（購自上海斯萊克實驗動物有限公司）。隨機等分成3組。烏司他丁組（UTI組）制模前1h肌注UTI（天普洛安，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）10萬U/kg，對照組和膿毒癥組則分別肌注平衡液5mL/kg；UTI組和膿毒癥組均按Otero等[4]介紹的CLP方法建立大鼠腸源性膿毒癥模型。正常對照組則行開腹、關腹，但不予盲腸結(jié)扎穿孔。3組術(shù)畢均皮下注射平衡液50mL/kg以補充術(shù)中丟失的體液并抗休克治療，術(shù)后正常飲食、自由飲水。

表1 已推定代謝物的MS裂解碎片及其在各組大鼠血清中的相對濃度（±s）

表1 已推定代謝物的MS裂解碎片及其在各組大鼠血清中的相對濃度（±s）

注：與對照組相比aP＜0.05，與烏司他丁組相比bP＜0.05

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1.2 血液標本的采集于術(shù)后12h經(jīng)尾靜脈采血0.5mL，靜置、離心后收集上清液，-80℃凍存，待行HPLC／MS分析。HPLC／MS分析前，取出冷凍標本，自然解凍后取血清200μL加至含乙腈400μL的1mL離心管中，充分振蕩30s、靜置10min后1000G離心5min，取上清液，經(jīng)0.2μL注射器式濾器過濾后行HPLC／MS分析。

1.3 觀察指標 Agilent-1100型分析儀(Agilent，MA，USA)進行HPLC／MS分析。高效液相色譜梯度洗脫程序、相關步驟、數(shù)據(jù)處理及標志物鑒定方法參照文獻[3]的研究設計。

1.4 統(tǒng)計學方法 通過比較各組間差異有統(tǒng)計學意義的代謝物的關系來說明烏司他丁對膿毒癥大鼠臟器的良好保護作用及HPLC/MS對膿毒癥的早期診斷的重要意義。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析（PCA）采用PCA方法對對照組、膿毒癥組和烏司他丁預處理組的正、負離子模式下對血清樣本的代謝譜數(shù)據(jù)進行模式識別。根據(jù)各組大鼠血清的總離子色譜圖(total ion chromatograms，TIC)，比較分析質(zhì)荷比和保留時間，從每一樣品中總共確認了787個譜峰。并通過ANOVA檢驗從其中找出差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的155個譜峰。對HPLC／MS數(shù)據(jù)進行PCA后，可獲得由第一、第二主成分構(gòu)成包含了60%的總方差的PCA得分圖(圖1A)。該得分圖提示，所有樣品完全按照組別進行聚類，這表明基于HPLC／MS的代謝組學技術(shù)能很好地反映假手術(shù)組、膿毒癥組和烏司他丁預處理組大鼠血清樣品的代謝特征，并將其完全區(qū)分開來。

2.2 重要代謝物的鑒定和分析 從載荷圖（圖1B）圓外區(qū)域，12個組間差異具有統(tǒng)計學意義的代謝物可以認定。經(jīng)數(shù)據(jù)庫查找、QT-TOF LC／MS裂解碎片驗證，8個代謝物被結(jié)構(gòu)性推斷，它們是亞麻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、軟脂酸、亞油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯醇；如表1所示，假手術(shù)組大鼠血清亞油酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、軟脂酸和硬脂酸水平最高，其次是UTI組，再次是膿毒癥組。這表明，UTI預處理組與膿毒癥組相比，血清中上述游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)濃度明顯升高，且差異具有顯著意義（見表1）。這表明UTI預處理后，具有抗炎癥、抗氧化作用的多不飽和脂肪酸血清水平明顯增加，這可能改善膿毒癥大鼠預后。

圖1 A圖：橄圓內(nèi)為膿毒癥組，正方形內(nèi)為生存組，余為對照組。B圖：圓形為Hotelling’s T2統(tǒng)計量閾值為變量，圓外的變量為組間差異有統(tǒng)計學意義的代謝物(P<0.05)。

2.3 療效的判斷 標志物信息構(gòu)建的模型有其臨床的參考價值，但利用所有代謝物信息構(gòu)建的模型預測效能總體上會高一些，在方法上采用RBFNN構(gòu)建的模型預測效能高于k-NN[3]。

3 討論

膿毒癥作為內(nèi)、外科危重病人常見的病，?？砂l(fā)展為膿毒癥性休克、多器官功能障礙綜合征。在此種情況下往往存在機體高代謝和高消耗為主要特征的代謝紊亂，常表現(xiàn)為蛋白強噬性和自噬性的負氮平衡及組織對葡萄糖攝取和脂肪代謝障礙等代謝紊亂[5]，對病情的發(fā)展起著重要的推進作用。本實驗采用代謝組學方法來分析膿毒癥時機體早期的代謝變化及烏司他丁是否對其表達起調(diào)節(jié)作用，以實現(xiàn)膿毒癥的早期診斷以便及時干預，以延緩病情改善愈后。

3.1 烏司他丁對膿毒癥的治療作用 研究表明烏司他丁能抑制胰蛋白酶、α糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等多種水解酶的活性。結(jié)構(gòu)上，UTI具有兩個活性功能區(qū)，這種不完全重疊且有多種酶的獨立結(jié)合位點決定了它的廣譜抑酶活性，可同時抑制胰蛋白酶、α糜蛋白酶、磷脂酶A2、酸性蛋白酶、粒細胞彈性蛋白酶、羧基肽酶、巰基酶等多種水解酶的活性，且抑制效率高從而減輕水解酶對正常組織器官的傷害，一定程度上清除致炎因子，緩解炎癥反應。同時有研究表明UTI對單核/巨噬細胞、中性粒細胞過度釋放的炎癥介質(zhì)也有抑制作用[6]。此外研究還發(fā)現(xiàn)它能夠抑制肺泡溶酶體酶及各種炎癥因子產(chǎn)生,穩(wěn)定溶酶體膜而保護肺臟，維持呼吸功能[7-9]。

3.2 建模時機 研究發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后12h，膿毒癥大鼠血清代謝特征已發(fā)生明顯改變,故本實驗把血液標本采集時間點設在膿毒癥大鼠建模后的12h[3]。

3.3 膿毒癥患者脂類代謝的特異性 膿毒癥患者機體處于高度的應激狀態(tài)，代謝發(fā)生劇烈的變化：血糖升高、脂肪動員增強、蛋白質(zhì)分解增強[10]。但膿毒癥后，機體中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)卻呈明顯下降趨勢[11]。游離脂肪酸主要參與氧化供能，比如亞油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、軟脂酸和硬脂酸，且其降低程度與膿毒癥預后呈負相關[3]。本試驗中發(fā)現(xiàn)與對照組相比，經(jīng)烏司他丁預組大鼠的游離脂肪酸明顯高于膿毒癥組，且趨向于接近對照組（P<0.05）。說明烏司他丁能有效的保護膿毒癥患者，提高患者的血中不飽和脂肪酸的濃度，從而保證了患者機體的氧供。其機理可能為烏司他丁抑制了內(nèi)毒素和炎癥因子釋放，降低了脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白活性同時抑制FAT／CD36基因的表達，進而減少FFA被快速轉(zhuǎn)運至肌肉或組織的機會[11]，故烏司他丁組大鼠血中FFA總體水平下降不明顯從而對膿毒癥患者的能量代謝起改善作用。

近年來研究表明膿毒癥時免疫系統(tǒng)的紊亂是促使病情發(fā)展的重要原因。在機體遭到強烈刺激時，補體C5a經(jīng)旁路途徑大量產(chǎn)生，使中性粒細胞功能下降，增加了感染的易感性。大量炎癥介質(zhì)釋放，如TNF-α、IL-1、GM-CSF等[12]，從而中性白細胞凋亡率下降，血中的中性白細胞數(shù)顯著增加；由于粒細胞脫粒時釋放髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、蛋白酶氧自由基、纖溶酶原激活物等。這些代謝都可增加了自身機體組織的損壞。因此，在過度免疫的情況下一方面機體對致病菌的易感性增高，使炎癥反應持續(xù)并加劇[13]。機體在感染和創(chuàng)傷刺激下，不僅釋放促炎介質(zhì)，同時也反饋性釋放內(nèi)源性抗炎介質(zhì)（IL-4、IL-10、TGFβ），引起機體免疫抑制。然而研究表明ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFAs）具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[14-15]。ω-3 PUFAs抗炎及免疫作用的主要機制是ω-3 PUFAs通過與花生四烯酸競爭代謝通路來抑制炎癥細胞因子白介素-1β( I L-1β)和腫瘤壞死因子-α( T NF-α)的分泌，還能抑制 PGE2和LTB4的生成，減少白細胞的游走和滲出使炎癥的消退組織修復加快[16-17]。同時ω-3 PUFAs作為細胞膜的組成成份可抑制脂筏信號轉(zhuǎn)導通路而對免疫細胞起抑制作用。此外ω-3 PUFAs及其代謝產(chǎn)物也能影響免疫細胞活性的作用即抑制抗原呈遞作用而抑制淋巴細胞激活及免疫分子表達等[18]。ω-3 PUFAs一族中藥理功能明顯的是亞麻酸和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。而本實驗中的UTI預處理組大鼠血液中的亞麻酸、DHA明顯高于膿毒癥組，從一定程度上可以說明UTI對機體的免疫調(diào)節(jié)有作用，可作為臨床膿毒癥患者的輔助治療藥物。

綜上所述，膿毒癥導致機體的代謝紊亂特別是與能量代謝相關的不飽和脂肪酸代謝的紊亂對其病程的發(fā)展起著重要的作用。經(jīng)過UTI預處理膿毒癥大鼠脂代謝的紊亂得到不同程度的糾正，表明UTI在一定程度上對膿毒癥患者機體的脂代謝紊亂有改善作用，可緩解病情，爭取治療時間。

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