單、雙標記基因篩選的轉人乳鐵蛋白基因供核細胞生產克隆山羊效率的比較

安禮友，袁玉國，于寶利，楊廷佳，成勇

揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009

細胞核移植方法生產轉基因動物已被廣泛用于生產重組蛋白。目前通過轉基因克隆動物，表達的重組蛋白有人乳鐵蛋白[1]、人凝血因子Ⅸ[2]、人溶菌酶[3]、血紅蛋白生成素[4]、人血清白蛋白[5]等。但轉基因克隆動物的出生率還很低，轉基因克隆的成功率還受諸多因素制約，如：表達載體、供核細胞、卵母細胞、核移植程序、外源基因對胚胎發(fā)育的影響等[6]。

因為轉基因細胞通過分泌保護性蛋白或細胞接觸保護非轉基因細胞，藥物篩選可能得到的是轉基因和非轉基因的混合細胞。有報道，藥物篩選后的細胞用于體細胞核移植，新生的克隆動物有部分是非轉基因的[5,7]。藥物篩選得到的細胞株中，如存在非轉基因的細胞，利用PCR 方法無法檢測出非轉基因的細胞。綠色熒光蛋白(GFP)作為可視化的分子標記，已被用來生產轉基因克隆動物，如牛[8]、山羊[9]、豬[10]、鼠[11]、兔[12]，GFP 在細胞內的表達能指示出抗性細胞株中細胞株基因整合情況。

本研究分別利用單標記基因(Neor)表達載體pBLC14和雙標記基因(Neor/GFP)表達載體pAPLM 生產轉hLF 基因山羊，比較了其在供核細胞篩選上的特點，以及在體細胞核移植中對克隆效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Taq 酶、內切酶、修飾酶購自TaKaRa 公司；DMEM/F12、FBS 購自Invitrogen 公司；G418購自AMRISCO 公司；細胞培養(yǎng)板購自NUNC 公司；其他試劑除特殊說明外，均購自Sigma 公司；實驗用羊購自揚州地區(qū)。

1.2 轉基因表達載體

單標記基因(Neor)乳腺特異性表達載體pBLC14為本實驗室保存(圖1)[13]，載體為β-乳球蛋白基因調控區(qū)指導的人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達載體，包括β-乳球蛋白基因調控序列(BLG)、巨細胞病毒啟動/增強子(CMV)、人乳鐵蛋白(hLF) cDNA 和新霉素抗性基因(Neor)。

雙標記基因(Neor/GFP)乳腺特異性表達載體pAPLM 為本實驗室構建(圖1)[14]，包括αs1酪蛋白基因調控序列(αs1-CN)、巨細胞病毒啟動/增強子(CMV)、人乳鐵蛋白(hLF) cDNA、新霉素抗性和綠色熒光蛋白雙標記基因(Neor/GFP)。

pBLC14與pAPLM 分別以Sal Ⅰ+ NotⅠ雙酶切獲得真核表達片段，經膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN)回收片段，DNA溶于雙蒸超純水中并定量，用于細胞轉染。

圖1 pBLC14和pAPLM 轉基因表達載體Fig.1 pBLC14 and pAPLM transgenic expression vectors.

1.3 胎兒成纖維細胞的原代培養(yǎng)

無菌手術獲取35日齡奶山羊胎兒，去除胎兒頭四肢及內臟團，剪碎胎兒組織，0.25%胰蛋白酶37℃消化10 min，消化懸液離心收集細胞并計數，然后用細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS)懸浮細胞，密度到5×105個/mL；細胞接種到175 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)。

1.4 基因轉染胎兒成纖維細胞及G418篩選

P2代胎兒成纖維細胞長至80%匯合時，進行轉染，0.05%胰酶+0.04% EDTA 消化回收細胞，離心后用低滲電轉染液(Hypoosmolar buffer，Eppendorf 公司)清洗細胞并計數細胞；用低滲電轉染液懸浮細胞至細胞密度至3×106個/mL，分別加入pBLC14與pAPLM 片段進行電轉染，使DNA 濃度為20 mg/L，將混合液移入電極間隙為2 mm 的電轉染杯(Eppendorf 公司)，在270 V，100μs 條件下電擊1次(Multiporator,Eppendorf 公司)，室溫靜置8 min，細胞稀釋后接種到24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；12 h 后換新鮮細胞培養(yǎng)液。

胎兒成纖維細胞轉染pBLC14與pAPLM 基因后36 h，換抗性培養(yǎng)液(DMEM/F12+10%FBS+600 mg/L G418)培養(yǎng)；篩選8～10 d，對孔中生長的單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)，以300 mg/L G418維持，細胞擴增到12孔板中生長匯合時，部分用凍存液(DMEM/F12+20% FBS+10%DMSO)凍存細胞，部分擴大培養(yǎng)用于外源基因整合檢測。

1.5 pAPLM 細胞的熒光觀察

轉染pAPLM 細胞篩選8 d 左右，對細胞克隆進行細胞熒光觀察。D-Hank's 清洗細胞后換入新鮮培養(yǎng)液；在熒光倒置顯微鏡(OLMYPUS IX71)下觀察細胞熒光(λex：470～490 nm，λem：510～550 nm)；并對每個細胞克隆進行細胞熒光率統(tǒng)計，細胞熒光率＝每視野熒光細胞數/每視野細胞數×100%；生長能力好、有熒光的細胞株進行傳代培養(yǎng)，并進行細胞熒光率統(tǒng)計。

1.6 細胞轉基因檢測

轉染pBLC14與pAPLM 基因細胞克隆，在24孔培養(yǎng)板中長至80%匯合時，消化收集細胞，經細胞裂解后直接進行PCR 轉基因整合檢測。每孔細胞(5000個細胞)使用50μL 細胞裂解液(40 mmol/L Tris-HCl，pH 8.9，0.9% Triton X-100，0.9% Nonidet P-40，0.4 g/L 蛋白酶K)45℃裂解1 h，8510 min

℃滅活蛋白酶K，取4μL 作為模板進行PCR 反應，檢測引物為CMV-LF 跨接頭引物CMV-LF 1/CMV-LF 2(表1)；PCR 產物進行測序驗證。

1.7 體細胞核移植及胚胎融合、激活

轉染pBLC14細胞，PCR 檢測陽性細胞株用作供核細胞；轉染pAPLM 細胞，所有細胞在傳代中有熒光的細胞株選作供核細胞。供核細胞經血清饑餓(DMEM/F12+0.5% FBS)48 h 后用于細胞核移植。

在細胞核移植0.5 h 前，0.25%胰酶消化收集血清饑餓細胞，M2懸浮細胞使細胞密度為1×106個/mL；細胞懸液放入eppendorf 離心管中，37℃孵育待用。

供質卵母細胞來自超排的長江三角洲白山羊，注射LHRH 之后28 h，通過外科手術方法從供體母山羊輸卵管中回收，用透明質酸酶消化去除顆粒細胞。

去核、移核、電融合及激活等細胞核移植方法參照文獻[15]。

1.8 胚胎移植及妊娠檢查

激活后的胚胎在激活后8～10 h，經外科手術移植到同期自然發(fā)情的受體輸卵管中，每只受體移植8～14枚胚胎；胚胎移植后，分別在35、60 d進行B 超診斷受體妊娠情況。

1.9 出生的克隆山羊PCR、Southern blotting外源基因整合檢測

剪取新生山羊耳尖皮膚，經蛋白酶K 消化6 h 后，提取組織DNA。共使用3對引物進行PCR擴增檢測外源基因整合，第1對引物LF 1/LF 2擴增人乳鐵蛋白基因；第2對引物NEO 1/NEO 2擴增Neo 基因；第3對引物GFP 1/GFP 2擴增GFP 基因(pAPLM 適用)。引物序列見表1。

新生山羊基因組DNA 用EcoR Ⅴ消化過夜，1%瓊脂糖凝膠分離消化后的基因組，DNA 轉移到正電尼龍膜上，Neor-dig 標記探針雜交，NBT/BCIP 顯色(Roche，DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)。

1.10 pAPLM 轉基因山羊體細胞熒光觀察

取新生山羊耳尖皮膚，用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)皮膚成纖維細胞，利用熒光倒置顯微鏡觀察細胞熒光；皮膚細胞經5-Aza-2’-deoxycytidine(2μmol/L)和Trichostain A (5μmol/L)處理，48 h 后去除藥物并觀察細胞熒光。

表1 PCR 檢測所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 結果

2.1 pBLC14與pAPLM 供核細胞的準備

表達載體pBLC14轉染胎兒成纖維細胞，G418篩選共得到細胞34株，20株細胞PCR 鑒定為陽性(表2)，其中7株作為供核細胞。

表達載體pAPLM 轉染胎兒成纖維細胞，經G418篩選共獲得抗性細胞30株，其中26株為PCR 鑒定陽性；陽性細胞株在熒光顯微鏡下觀察熒光，PCR 鑒定陰性的細胞株未觀察到熒光，PCR 鑒定陽性的26細胞株中有23株可觀察到熒光，在觀察到熒光的23細胞株中，其中12株細胞的熒光檢出率為100%，即每個細胞均有熒光；這些細胞傳代后，有12、10、11株細胞分別在P7、P9、P11代觀察到每株細胞均有熒光，其中6株細胞在傳代過程中始終每個細胞均可見熒光(見表2和圖2)，該6株細胞作為供核細胞用于體細胞核移植。

2.2 pBLC14與pAPLM 克隆山羊的生產

共使用供體山羊136頭，獲得成熟卵母細胞1266枚，制作重構胚1066枚，融合重構卵806枚，770枚融合胚胎移植入72只受體山羊(表3)。

轉pBLC14基因細胞核移植，在胚胎移植后35 d、60 d 進行B 超妊娠診斷，分別有14、7只受體妊娠；期間1只受體流產1只胎兒；最終3只妊娠到期，出生5只羔羊(表3)；4只羔羊分別在出生后1、7、50 d 死亡，1只存活至今。

圖2 pAPLM 轉染胎兒成纖維細胞熒光蛋白表達Fig.2 GFP expression in pAPLM transfected fibroblast cells.

轉pAPLM 基因細胞核移植，在胚胎移植后35、60 d 進行B 超妊娠診斷，分別有18、10只受體妊娠；其中有2只受體未發(fā)育到期流產胎兒3只；最終6只受體羊妊娠到期，出生羔羊7只(表3)；3只羔羊分別在出生后7、30、90 d 因呼吸系統(tǒng)疾病死亡，4只存活至今。

2.3 出生的克隆山羊外源基因整合檢測

PCR 分析來自pBLC14轉基因供核細胞的克隆山羊基因組DNA，從所有出生的克隆山羊擴增獲得435 bp (Neor)和475 bp (hLF)片段(圖3)，顯示流產胎兒及出生山羊基因組中整合有pBLC14基因，Southern blotting 結果也進一步證實外源基因的存在(圖5)。

PCR 分析來自pAPLM 轉基因供核細胞的克隆山羊基因組DNA，分別擴增獲得GFP (507 bp)，Neor(435 bp)和hLF (475 bp)基因片段(圖4)，Southern blotting 結果進一步證實出生山羊均含有pAPLM 外源基因(圖5)。

表2 轉pBLC14和pAPLM 基因細胞株篩選特性Table 2 Selection details of pBLC14 and pAPLM transgene-transfected cells

表3 轉pBLC14和pAPLM 基因克隆山羊的制作效率Table 3 Efficiency of nuclear transfer using pBLC14 and pAPLM transgenic donor cells

圖3 出生的克隆山羊pBLC14外源基因PCR 整合檢測Fig.3 PCR analysis of pBLC14 transgene integration in cloned goats.The amplified products were a 435 bp fragment of the Neor gene (A),and a 475 bp fragment of the hLF gene (B).1:positive control (pBLC14 transgene vector);2:negative control (recipient goat);3?7:cloned goats L1,BL-4-1,BL-4-2,BL-8-1,BL-8-2;M1:200-bp DNA ladder marker;M2:DL2000 DNA marker.

圖4 出生的克隆山羊pAPLM 外源基因PCR 整合檢測Fig.4 PCR analysis of pAPLM transgene integration in cloned goats.The amplified products were a 507 bp fragment of the GFP gene (A),a 435 bp fragment of the Neor gene (B),and a 475 bp fragment of the hLF gene(C).1:positive control (pAPLM transgene vector);2:negative control (recipient goat);3?9:cloned goats L2,L3,L4,L5,L6,BL-67,and BL-40;M1:200 bp DNA ladder marker;M2:DL2000 DNA marker.

圖5 存活的克隆山羊外源基因Southern blotting 整合檢測Fig.5 Southern blotting analysis of transgene integration in living cloned goats.1:pAPLM transgenic kid L1;2?5:pCNLF-ng transgenic kids L3,L4,L5,L6;6:negative control (recipient goat);7:positive control(pAPLM vector).

2.4 pAPLM 轉基因山羊細胞熒光觀察

取新生pAPLM 克隆山羊耳尖組織培養(yǎng)獲得皮膚成纖維細胞，熒光倒置顯微鏡觀察顯示細胞無熒光；細胞經5-Aza-2’-deoxycytidine 和Trichostain A 處理，約有30%的細胞觀察到熒光(圖6)。

圖6 pAPLM 轉基因山羊細胞的熒光蛋白表達Fig.6 GFP expression in fibroblast cells of pAPLM cloned kids.Cells were treated with 5-Aza-2’-deoxycytidine and Trichostain A,observed under fluorescent microscopy with phase contrast filter (A) and FITC filter (B).

3 討論

在本研究中，應用單標記基因(Neor)和雙標記基因(Neor/GFP)作為胎兒成纖維細胞轉基因篩選標記。單標記基因(Neor)經G418篩選和PCR 檢測獲得整合外源基因的供核細胞；雙標記基因(Neor/GFP)經G418篩選、PCR 檢測和細胞熒光分析，獲得整合外源基因的細胞株。應用單和雙標記基因均成功地生產出轉人乳鐵蛋白基因克隆山羊。

通過體細胞核移植技術來生產轉基因動物，首先要獲得轉基因的供核細胞。利用G418藥物和PCR 篩選供核細胞，出生的克隆動物并非全部整合有外源基因[5,7]，表明通過抗生素篩選和PCR 檢測獲得的細胞株轉基因供核細胞同時包含轉基因供核細胞和非轉基因細胞。我們的實驗也證實了這一結果，Neor標記基因載體pBLC14轉染獲得的抗性細胞株中，只有58.8%(20)的細胞株PCR 檢測到外源基因；相對來說，在Neor/GFP 雙標記載體pAPLM 轉染獲得的藥物抗性細胞株中，86.7%(26)細胞株PCR 檢測到外源基因，其中只有76.7%(23)細胞株能觀察到熒光，細胞經傳代幾次后，僅有20%(6)細胞株中每個細胞均可見穩(wěn)定表達熒光。結果表明通過G418藥物篩選獲得的轉基因細胞株中存在少數非轉基因的細胞株，另外的80%細胞株不見熒光或部分細胞可見熒光。這一現(xiàn)象可能原因有：一是在細胞單克隆化細胞株的操作時混入了非轉基因細胞，不管是使用克隆環(huán)挑取細胞克隆還是用細胞有限稀釋法克隆化細胞株，都不能保證擴增的細胞株來源于單個細胞[16]，G418篩選的細胞具有“bystander”效應，抗性細胞能保護鄰近非轉基因細胞存活[7,17]；二是細胞長時間的篩選培養(yǎng)部分細胞表觀遺傳信息的改變，造成部分細胞失去表達GFP 蛋白的能力[9]；三是表達的GFP 蛋白存在于培養(yǎng)液中，進入非GFP 表達細胞內，熒光觀察前的簡要清洗不能完全去除，從而使細胞能觀察到熒光。而在我們的研究中，應用Neor/GFP 雙標記基因構建載體pAPLM 轉染胎兒成纖維細胞，在抗性細胞株傳代過程中，利用GFP 蛋白的表達來鑒定細胞株中單個細胞的外源基因整合，每個細胞在傳代中能連續(xù)觀察到熒光的細胞株選作核供體細胞，最大限度排除上述三種情況，確保篩選得到的供核細胞是轉基因的。雖然通過降低抗性篩選時的細胞接種密度也可以增加獲得轉基因單細胞克隆的機率和減少偽轉基因細胞，但是從根本上并不能保證單克隆化得到的細胞株是由一個轉基因的細胞擴增而來、排除非轉基因細胞混入[16]；此外，這種方法增加了轉基因細胞克隆化的難度，需要相當長的時間對細胞克隆進行擴增以滿足細胞核移植的需要，供核細胞在體外長時間的培養(yǎng)會降低細胞核移植的效率[18]。

單和雙標記基因篩選得到的供核細胞，均獲得出生的活山羊，經檢測均整合有轉基因。表明應用單和雙標記基因，均能獲得轉基因克隆動物。但是，在之前的研究報道中，單篩選基因往往會得到非轉基因動物[7,19]，表明出生非轉基因動物的風險依然存在。利用雙標記基因，至今還沒有獲得非轉基因動物的報道。因此，雙標記基因與單篩選基因相比，能提高轉基因動物的生產效率。

在體細胞核移植的過程中，比較了Neor與Neor/GFP 標記基因對制作細胞核移植動物效率的影響，包括重構胚制作效率(融合率)、胚胎發(fā)育能力(受體懷孕率、克隆山羊出生率)。pBLC14、pAPLM 載體的重構卵其融合率分別為76.6%和73.8%，35、60 d 檢查受體羊妊娠率分別為53.8%、26.9%和39.1%、21.7%，克隆山羊出生率(出生數/胚胎移植數)分別為1.9%和1.4%；與pBLC14相比，pAPLM 載體表現(xiàn)出較低的重構胚融合率、受體妊娠率和克隆山羊出生率，但差異不顯著(P＞0.05)。Neor與Neor/GFP標記基因對制作細胞核移植動物效率的影響的比較研究尚未見報道。

制作體細胞核移植山羊，以胎兒成纖維細胞作為供核細胞，Keefer、Melicna 和Yuan 等取得相似的山羊出生率(0.5、0.9和2.2%)[9,20-21]，出生動物也有近60%的死亡率，新生兒死亡的主要原因是肺部病灶。在我們的研究中出生率和死亡率分別為1.9%、80%(pBLC14)和1.4%、42.8%(pAPLM)，新生山羊的死亡與標記基因沒有直接相關性。以上數據表明單(Neor)與雙(Neor/GFP)標記基因對生產轉基因動物效率沒有明顯差異。pBLC14和PAPLM 載體在構建中，分別在Neor與Neor/GFP 標記基因前后植入了loxP 位點(圖1)，可以在優(yōu)良性狀的克隆羊中，通過Cre 酶刪除標記基因。

綜上所述，單、雙標記基因均對克隆效率沒有影響，兩者之間克隆效率也沒有顯著差異；雙標記基因的表達載體在供核細胞篩選的準確性和可靠性方面有明顯優(yōu)勢。

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