熒光PCR法對麻風現癥患者與治愈者鼻分泌物麻風桿菌檢測結果分析

蔡鑾端 鄭迪楠 鄭華生 林 旸 鄭睦暢

目前，麻風病在我國總體處于低流行水平，但每年仍有不少新發和復發病例。迄今為止，麻風桿菌的體外培養仍未成功，因此，建立檢測病原菌的方法尤為重要。熒光定量PCR是檢測麻風桿菌的新方法。過去認為麻風病通過皮膚直接接觸傳播，現在多數學者認為麻風病的傳播來源主要是鼻粘膜。為了解熒光定量PCR對鼻分泌物麻風桿菌檢測在麻風病診治及了解聯合化療(MDT)的效果和復發方面的情況，筆者于2010年5月～2012年7月對汕頭市澄海區的5例麻風現癥患者的不同時期，以及32例歷年經聯合化療(MDT)治愈的麻風存活者鼻分泌物進行熒光定量PCR檢測麻風桿菌DNA，同時與皮膚組織液同樣作PCR檢測結果作對照，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標本來源于5例麻風現癥患者和32例歷年經麻風聯合化療治愈者。5例麻風現癥患者中4例為多菌型（皮膚組織液抗酸染色均為陽性），1例為少菌型（抗酸染色陰性）；32例歷年存活者經WHO推薦的麻風聯合化療方案（多菌型方案DDS+RFP+B663三聯治療2年或治愈；少菌型方案DDS+RFP6個月～1年）治愈，其中多菌型23例，少菌型9例，已治愈5～10年7例，已治愈＞10年25例。研究組41份鼻分泌物樣本來自的5例現癥患者治療前和4例多菌型現癥患者治療半年期及32例歷年治愈者，對照組標本取同一對象的皮膚組織液。

1.2 標本采集和處理 （1）鼻拭子標本：用拭子伸入被檢者鼻腔深處，緊貼鼻腔粘膜旋轉2～3周后取出，裝入拭管中冷藏；（2）皮膚組織液標本：取被檢對象浸潤明顯的活動性皮損或眶上、顴部、下頜和耳垂至少2個部位的皮膚組織液。常規消毒皮膚，戴消毒手套，用左手將患者皮膚捏緊提起使局部皮膚變白，右手切開一長5mm、深3mm的切口，用刀刃刮取組織液，粘于滅菌拭子放入密閉的離心管后冷藏。

1.3 麻風桿菌DNA的提取 麻風桿菌核酸熒光PCR檢測試劑盒是美國BioXL公司提供，按試劑盒的說明將待測標本加生理鹽水1mL充分混勻，10000r離心5min，棄上清液，再加50μL核酸提取液B后充分混勻，100℃處理10min，10000r離心5min后，取上清液4μL做PCR反應。

1.4 PCR擴增 擴增儀采用廣州中山大學達安公司的DA7600全自動基因擴增儀,每個反應管加入26μL試劑（MLPCR MIX 24μL+Taq酶系2μL），加入處理后DNA樣本或陽性定量標準品梯度（使用前用陰性質控品將ML-陽性標準品（1×107COPIES/mL）梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×106COPIES/mL，1×105COPIES/mL，1×104COPIES/mL）和陰性質控品4μL，10000r 30s。反應條件：93℃→2min，后93℃5s→56℃ 45s，共40個循環。

1.5 結果判定 調節標準曲線至最佳，儀器自動分析計算出待測標本數值，陰性為＜103COPIES/mL；陽性為≥103COPIES/mL（不同級別拷貝數103或104、105、106）。

1.6 統計學方法 采用SPSS12.0軟件進行統計學分析，計數資料用χ2檢驗進行統計分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組熒光PCR結果陽性率比較 41份鼻分泌物標本經熒光PCR檢測麻風桿菌DNA結果陽性7份，陰性34份；對照組皮膚組織液標本經熒光PCR檢測麻風桿菌DNA結果陽性8份，陰性33份，兩組檢測結果陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=0.082，P＞0.05），見表1。

表1 兩組標本PCR陽性率比較

2.2 麻風現癥患者熒光PCR檢測結果 麻風現癥患者不同時期的9份鼻分泌物標本（其中來自抗酸染色陽性的多菌型患者8份和抗酸染色陰性的少菌型患者1份）熒光定量PCR檢測陽性7份，陰性2份；對照組9份皮膚組織液標本經熒光PCR檢測麻風桿菌DNA結果陽性8份，兩組具體拷貝數量級分布情況見表2，兩組陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 32例經聯合化療治愈者PCR檢測結果 未發現復發者，與臨床相符。32例治愈者的鼻分泌物樣本32份和皮膚組織液樣本32份做熒光定量PCR檢測麻風桿菌DNA均為陰性。

表2 麻風現癥患者熒光定量PCR檢測麻風桿菌DNA結果

3 討論

自1981年WHO推出MDT治療麻風病已經實施20余年，治愈了一大批麻風現癥患者。但近10年每年新發病例無明顯下降趨勢，一個重要原因是對麻風的傳播途徑未了解透徹[1]。而多菌型患者帶菌的鼻和上呼吸道作為傳染源越來越被重視。目前涂片抗酸染色鏡檢仍是麻風診斷和觀察療效的常規檢查方法。隨著分子生物技術的發展和成熟，敏感性和特異性皆高的分子生物學方法的研究應用將提高麻風病的早期診斷水平，阻斷其傳播，降低其新發病例。對于全球麻風流行的控制措施尤其重要[1]。

迄今麻風桿菌的體外培養仍未成功，因而建立檢測病原菌的方法尤為重要。目前PCR就成為研究麻風分枝桿菌的理想選擇。熒光定量PCR與普通PCR的不同，其采用閉管，無需PCR后處理，避免污染和假陽性；探針與DNA特異雜交，增強了特異性；可定量；檢測結果由光譜分析儀自動顯示，增強了靈敏性和客觀性。這種實時PCR改善了許多病原體的分子診斷，其優點在于能定量檢測臨床標本的DNA。有報道[2]此法已應用于麻風病臨床標本的檢測，特別是用在常規組織學染色不能檢測到菌的標本。Bang等[3]選擇了37例MB(多菌型）患者和32例PB(少菌型）患者進行PCR技術和其它傳統方法的比較。其中MB患者的BI(細菌密度）均為陽性，而PCR的陽性率為100%，PB患者的BI均為陰性，而PCR的陽性率為50%。因此相比較于傳統診斷方法，對于菌量較少的患者，PCR有其優越性。

本研究中，鼻分泌物組和皮膚組織液組檢測麻風菌結果基本一致，陽性率很接近，表明熒光定量PCR檢測鼻分泌物麻風桿菌DNA是可行的。另外，這種方法創傷小或無創傷，更易被患者接受。本研究PCR檢測結果同常規診斷結果基本相符。熊俊浩等[4]用麻風分枝桿菌PCR技術，以16SrRNA作引物，對麻風流行地區的72例經傳統方法診斷的麻風病患者和45例健康自愿受試者進行檢測，結果與傳統方法診斷基本一致。

評價MDT療效的最重要的指標是完成治療后的復發率。本研究中，檢測結果與臨床相同，未見復發；對32例皮膚組織液做熒光定量PCR檢測麻風桿菌DNA，結果均為陰性。

從本研究中可以看出，聯合化療治療麻風病效果好，復發少。熒光定量PCR檢測鼻分泌物麻風桿菌DNA可做為診斷和監測麻風的新方法。由于病例較少，還有待進一步研究探討。

[1]田蔚蔚.麻風桿菌的分子生物學檢測研究進展[J].中國麻風皮膚病學雜志，2010，26（6）：416-418.

[2]吳勤學，宋順鵬，呂成志，等.麻風分子生物學研究新進展[J].中國麻風皮膚病學雜志，2010，26（2）：121-122.

[3]Bang PD,Suzuki k,phuong LT,et al.Evaluation of Polymerase Chain reaction-based detection of Mycobacterium Leprae for the diagnosic of leprosy[J].J Dermatol,2009,36（6）：269-276.

[4]熊俊浩，雍剛，喻林沖.多聚酶鏈技術在麻風診斷中的應用研究[J].預防醫學情報雜志，2001，17（2)：68-69.