小型四倍體西瓜低稔性胚胎發育研究

詹園鳳，鄭鋒，黨選民

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室，海南儋州，571737）

人工誘導的多倍體作物具有一定優勢，如品質更優、抗性增強等，但也伴隨著稔性降低等諸多問題[1，2]。對小型西瓜四倍體育種研究發現，同源四倍體西瓜與二倍體相比，稔性明顯下降，有的四倍體西瓜甚至沒有正常發育的種子，嚴重影響四倍體西瓜的育種效率。而有關四倍體西瓜稔性低的原因，在細胞遺傳學、生理學等方面進行了部分研究[3～6]。本研究旨在對二倍體與同源四倍體西瓜受精前后生殖特性進行比較研究，探討四倍體西瓜低稔性的原因，為提高四倍體西瓜結籽率提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所選育的二倍體高代自交系049（2X）和用Oryazalin誘變的四倍體049（4X）。

1.2 試驗方法

①田間試驗與樣品采集 試驗于2010年5月開始在中國熱帶農業科學院冬季瓜菜研究中心試驗基地大棚內進行。催芽后播種于營養缽中，待幼苗長至2～3片真葉時移栽，按常規方法管理。開花期，每天下午將雌花和雄花套袋隔離，次日上午自交授粉，授粉后繼續套袋隔離，并掛牌標記。授粉后0.5，1，2，3，4，5，7，9，12 h 摘取不同倍性雌蕊各 5枚； 授粉后 8，12，16，20，24，30，36，42，48，72 h 摘取不同倍性子房各 5 枚；授粉后 4，5，6，7，8，9，10，12，14，16 d取不同倍性子房的胚珠各20粒，所取材料均用FAA固定液保存備用。

②花粉管生長觀察 采用熒光染色法觀察花粉管生長。雌蕊材料從FAA固定液中取出，依次經過 70%（體積分數，下同）酒精（2 次）、50%酒精、30%酒精、蒸餾水浸泡，每次30 min；將材料放入5 mol/L的NaOH溶液中室溫下軟化10 min；蒸餾水洗3次；用鑷子剝取柱頭，將柱頭放入苯胺藍溶液中染色10 min以上；將材料置于載玻片上，滴加1滴染色液，蓋上蓋玻片并輕壓，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

③胚胎發育觀察 采用石蠟切片法觀察胚的發育。子房及胚珠采用愛氏蘇木精整體染色法制作石蠟切片[7]，切片厚度為 8 μm；Olympus光學顯微鏡下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 不同倍性花粉粒萌發的觀察比較

不同倍性花粉粒在雌蕊柱頭上的萌發率不同（圖1）。授粉0.5 h后，二倍體與四倍體花粉粒均開始萌發，但四倍體花粉萌發數量明顯少于二倍體；授粉2 h后，二倍體與四倍體花粉的萌發率均達到最高，二倍體的花粉萌發率為96.3%，而四倍體的花粉萌發率僅為63.7%。熒光染色觀察表明，二倍體花粉粒形態整齊一致，在柱頭上分散性好，萌發率較高（圖3-1）；四倍體花粉粒大小不一，部分花粉粒畸形失去生活力，因而萌發率較低（圖3-2）。

2.2 不同倍性花粉管在花柱中的生長

二倍體花粉管生長速度快，花粉管粗細均勻，生長整齊一致 （圖3-3）。四倍體花粉管粗細不均勻，在生長過程中發生扭曲、折疊、盤繞、頂端膨大等異常現象（圖3-4）。二倍體花粉粒萌發時只產生一根花粉管，但四倍體花粉粒萌發有時會出現一萌發孔雙花粉管（圖3-5）、二萌發孔雙花粉管（圖3-6）和三花粉管等多花粉管現象（圖3-7）。

觀察結果 （圖2）表明，二倍體與四倍體花粉管在花柱內每個時間段的生長速度并不一致。從萌發開始花粉管的生長速度不斷加快；在授粉后5 h，二倍體與四倍體花粉管的生長速度最快，二倍體速度為1.293 mm/h，四倍體速度為1.088 mm/h，之后花粉管的生長速度又開始下降。大約在授粉后9 h，二倍體花粉管到達花柱的基部（圖3-8），開始進入子房；而四倍體花粉管在授粉后12 h才到達花柱基部（圖3-9），生長速度相比二倍體明顯要慢得多。

2.3 不同倍性西瓜胚胎的發育

西瓜子房內著生多個倒生胚珠，胚珠中心為珠心，內含有胚囊，整個胚囊為珠心細胞所包圍（圖3-10）。成熟的西瓜胚囊為寥型胚囊，8核、7細胞的結構，包括1個卵細胞、2個助細胞、2個中央細胞核（極核）和3個反足細胞。胚囊完成雙受精后，形成合子與初生胚乳核，而初生胚乳核不休眠、分裂形成胚乳游離核，前期胚乳游離核數量很少，游離在胚囊周圍（圖3-11）。合子經過短暫休眠后開始分裂，形成基細胞和頂細胞的2細胞原胚，頂細胞經多次分裂形成多細胞原胚（圖3-12），之后原胚快速發育成球胚（圖3-13），而胚乳游離核則在球胚前期開始由珠孔端向合點端靠近，并與游離在胚囊周圍的胚乳游離核一起快速形成一管狀的胚乳吸器（圖3-14），胚乳吸器頂端插入珠心細胞吸收營養物質，到球形胚晚期胚乳吸器開始細胞化。球形胚晚期遠離孔端的細胞分裂加快，靠近珠孔端的細胞分裂速度稍慢，胚體發育成上窄下寬的梨形胚（圖3-15）；而胚乳游離核則細胞化并包圍在梨形胚周圍；梨形胚繼續分裂，開始形成子葉原基，胚體發育形成心形胚（圖3-17），心形胚迅速演化為魚雷胚（圖3-17），之后細胞化的胚乳吸器開始解體，退化成不規則的條狀，發育形成子葉胚（圖3-18），而胚乳則完全解體被子葉吸收。

圖1 不同倍性花粉粒萌發率的比較

圖2 不同倍性花粉管生長的比較

二倍體西瓜授粉約16 h后開始受精，經過2～4 h完成雙受精過程。授粉后48 h合子開始細胞分裂形成多細胞原胚；至第3天，原胚發育形成小球胚，隨后小球胚發育成大球胚；至第5天，形成梨形胚；至第6天，胚體發育形成心形胚；至第7天，心形胚迅速演化為魚雷胚。至第9天，魚雷胚發育形成子葉胚，最后形成成熟的胚。

四倍體與二倍體受精過程、胚胎與胚乳的發育幾乎相同，只是受精的時間較晚，胚胎發育時間長些，四倍體西瓜授粉42 h后花粉管進入胚囊，4～6 h完成雙受精過程；四倍體原胚期較二倍體時間長，且有部分胚囊敗育（圖3-19），至第6天才形成小球形胚，第8天形成梨形胚，第9天發育成心形胚，隨后快速發育成魚雷胚，最終形成子葉胚。四倍體胚胎在發育的過程中，因原胚期、球胚期、心形胚期或魚雷胚期，胚乳細胞過早地解體，而不能夠為胚體提供營養，致使胚體退化（圖3-19，20），最終敗育，形成沒有種仁的空種子。

3 結論與討論

3.1 四倍體花粉粒萌發及花粉管生長與雌蕊的關系

被子植物雙受精過程中具有多個識別位點，主要可分為花粉與柱頭、花粉管與花柱以及雌雄配子之間3個部位，任何一個部位不能正確識別都有可能產生生殖障礙，導致敗育[8]。本試驗結果表明，小型四倍體西瓜花粉活力下降，在柱頭上的萌發率較低，僅為63.7%；花粉管在柱頭內生長緩慢，且花粉管發生扭曲、折疊、盤繞、頂端膨大、出現多花粉管等異常現象，可見花粉在柱頭上的萌發以及花粉管的伸長等都受到了不同程度的抑制，導致進入胚囊的花粉管數量減少，雙受精成功率較低，這可能是造成四倍體低稔性的重要原因。譚素英等[4]在研究多倍體西瓜花粉萌發生長與內源激素的關系時發現，花粉粒萌發率低，花粉管在花柱中生長緩慢，與花粉中玉米素核苷（ZR）含量過高、雌蕊的生長素（IAA）和赤霉素（GA3）與脫落酸（ABA）的比值低、及花粉和雌蕊共同作用有關。

圖3

3.2 四倍體西瓜胚胎敗育與胚乳的關系

西瓜胚的發育屬于紫菀型，胚乳的發育屬于核型。西瓜胚囊在雙受精后，胚乳先于合子發育，為幼胚的發育提供營養物質，而胚乳的敗育會導致胚的敗育。薛志強等[6]對少籽西瓜材料內源激素含量變化與胚胎敗育關系研究結果表明，內源激素的相對虧損可能對胚敗育起了重要作用，少籽西瓜在球形胚時期，IAA、GA3和異戊烯腺苷（iPAs）的相對虧損達30%～70%，而ABA則相對富足，內源激素動態變化及它們之間的比例平衡與西瓜胚胎敗育有著密切聯系。譚素英等[3，4]、謝興剛[5]的研究結果表明，四倍體西瓜在胚發育過程中，因胚乳游離核異常解體或胚乳細胞過早的解體，導致在原胚、球形胚、心形胚或魚雷胚階段退化敗育，最后只有少數的胚與胚乳發育正常形成有活力的成熟種子。這與本研究結果相似，但本研究的小型西瓜胚胎發育的時間較早，發育速度快，這可能是由于本試驗小型西瓜為早熟品種，加上海南的夏季高溫影響果實內源激素及養分的積累而導致果實生育期縮短，相關影響機制還有待進一步研究。

[1]張蜀寧，萬雙粉，張偉，等.同源四倍體青花菜花粉母細胞的減數分裂[J].園藝學報，2007，34（2）：387-390.

[2]中國農業科學院鄭州果樹研究所.中國西瓜甜瓜[M].北京：中國農業出版社，2000：272-276.

[3]譚素英，梁毅.同源四倍體西瓜胚胎發育研究[J].中國西瓜甜瓜，1998（1）：2-5.

[4]譚素英，梁毅.同源四倍體西瓜自交花粉萌發生長內源激素的關系[J].華北農學報，2000，15（4）：73-78.

[5]謝興剛.不同倍性西瓜胚胎發育及西瓜組培玻璃苗細胞學研究[D].太原：山西大學，2008.

[6]薛志強，徐道娜，張勇，等.少籽西瓜內源激素含量變化與胚胎敗育的關系[J].西北農業學報，2007，16（3）：184-187.

[7]李和平.植物顯微技術.2版[M].北京：科學出版社，2009.

[8]徐恒平，曾宗巽.被子植物雌雄配子及其表膜特異蛋白研究進展[J].大自然探索，1995，14（3）：50-55.