一株產膠原蛋白酶沙雷氏菌的分離及鑒定

四川農業大學生命科學與理學院 趙海霞 趙培培 陳 惠 吳 琦＊

膠原蛋白酶是可作用于膠原或變性明膠而不作用于其他蛋白質的酶類，其可以斷裂膠原蛋白，斷裂的碎片自動變性，進而被普通蛋白酶水解（Gallop和Seifter，1963）。 膠原蛋白酶對膠原蛋白的特異降解性，使其廣泛應用于飼料工業、環境保護、醫學、食品工業和化工等領域。膠原酶包括動物源膠原酶和微生物源膠原酶。目前報道的膠原酶產生菌主要有Bacillus pumilus（吳琦等，2007）、Bacillus licoeniformis （Asdornnithee 等 ，1994），Bacillus sp. （Nakayama 等 ，2000）、Borrelio burgdorferi （Grab 等，1996）、Streptococcus gordonii（Juarez 和 Stinson，1999）和 Clostridum perfringens（Matsushita等，1994）。本研究從土樣中篩選到一株膠原蛋白酶產生菌，經試驗鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescen），以期為進一步的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 雅安市畜肉市場和污水口等處采集土樣和水樣。

1.1.2 主要藥品及試劑 引物由上海英駿生物技術有限公司合成；rTaq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA Ligase、pMD18-T Vector凝膠回收試劑盒、DNA MarkerVII、蛋白質Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（100 μg/mL），酸性 Ⅲ 型 膠 原 蛋 白 （Sigma 公 司 ），NaCl、HgCl、NaOH、濃HCl、胰蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、K2HPO4·3H2O、蔗糖、MgCl2、聚乙二醇 20000、瓊脂粉、瓊脂糖和Tris等。

1.1.3 培養基 按照楊光垚等 （2004）配置培養基。 種子培養基（1000 mL）：牛肉膏 5 g，NaCl 5 g，蛋白胨 10 g，pH 7.2 ～ 7.4；富集培養基（1000 mL）：明膠 1 g，NaCl 5 g， 蛋白胨 5 g，pH 7.2 ～ 7.5；初篩培養基（1000 mL）：明膠 20 g，NaCl 0.1 g，蛋白胨 5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH 7.2 ～7.5；復篩培養基（1000 mL）：葡萄糖 20 g，酵母粉1.5 g， 胰蛋白胨 10 g，CaC120.05 g，NaH2PO4·2H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，pH 7.0 ～ 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 膠原蛋白酶產生菌的篩選

1.2.1.1 富集培養 取樣品2 g或2 mL，用生理鹽水18 mL浸泡搖勻后放置10 min，在沸水浴中處理5 min，冷卻后按0.5%的量取懸浮液接種于裝有富集培養基的三角瓶中，180 r/min，37℃搖瓶培養2 d。

1.2.1.2 膠原蛋白酶產生菌的初篩 將富集培養液進行梯度稀釋至 10-6，10-7，10-8三個梯度，各取50 μL進行涂布初篩平板，涂布均勻后放入37℃溫箱中培養24 h。觀察菌落生長情況，選取具有隱約透明圈的菌落，轉接平板，編號記錄。將初篩菌在37℃溫箱中培養24 h，在平板菌落周圍滴加酸性汞試劑，菌落周圍出現透明圈者為陽性。挑選明膠水解圈與菌落直徑比值較大的菌株保存。1.2.1.3 牛皮消化試驗 挑選明膠水解圈與菌落直徑比值較大的菌株，分別接種于種子培養基中，37℃培養2 d。剪取約0.5 g重的新鮮小牛皮，滅菌后裝入試管，每管加入種子培養基上清液各2 mL（4000 r/min 離心 10 min），并標上對應的號，另取一管加入2 mL無菌種子培養基作為陰性對照，蓋上棉塞，室溫放置2 d，每12 h搖動一次，以便牛皮與酶液充分接觸。兩天后取出牛皮進行對照觀察。

1.2.2 膠原蛋白酶活性檢測 采用茚三酮顯色法，以Ⅲ型膠原蛋白作為底物，測定反應所釋放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸顯色制定標準曲線。酶活力單位定義為：在37℃，pH7.5條件下，1 mL酶液每分鐘水解膠原產生相當于1 μmol甘氨酸的量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 生理生化鑒定 根據分離菌的菌落和菌體形態，芽孢的有無和著生情況，革蘭氏染色以及生理生化反應，按《常見細菌系統鑒定手冊》進行初步分類（東秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2.3.2 16S rDNA的擴增與序列分析 將菌種接種于20 mL/150 mL種子培養基，37℃ 180 r/min培養12 h，采用革蘭氏陽性菌DNA out抽提試劑盒 （天澤基因工程有限公司）提取菌株總DNA。

上 游 引 物 序 列 （27F）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG， 下游引物序列 （1492R）：TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT。 PCR 反應體系 （25 μL）為：10×buffer2.5 μL，25 μM 的 MgCl20.5 μL，2.5 mM dNTP0.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，總 DNA0.5 μL，5 U/μL 的 rTaq DNA 聚 合酶 0.5 μL，超純水18.5 μL。 PCR擴增程序為：95℃預變性 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環30次；72℃延伸10 min。PCR產物經T載體克隆后，送上海英駿 （invitrogen）生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.3.3 系統發育分析 將菌株16S rDNA測序結果采用Blasting程序，與GenBank（http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）核酸數據進行比對分析，進行分子遺傳學鑒定（龍雯和陳存社，2006）。

2 結果

2.1 膠原蛋白酶產生菌的篩選及牛皮消化試驗

經富集培養后，梯度稀釋涂布于初篩平板上，確定具有明膠水解活性的菌株。初篩菌株經種子培養基培養后，取上清液對新鮮小牛皮進行室溫消化，從中篩選對牛皮消化效果好的菌株。結果表明，菌株Col-C的培養液能在48 h內對犢牛皮有消化作用，牛皮明顯變薄，而陰性對照組牛皮無明顯變化（見圖1）。因此，菌株Col-C能分泌膠原蛋白酶，且具有較強消化牛皮的能力。

圖1 牛皮消化試驗

2.2 膠原蛋白酶活力測定 采用茚三酮顯色法測定膠原蛋白酶活力，顯色后在570 nm處測光密度吸收值，測得Col-C的膠原蛋白酶活力達到21.19 U/mL。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態觀察 挑取該菌接于初篩平板上37℃培養24 h，菌落呈圓形，凸出平板。邊緣整齊，表面光滑，有亮澤。無褶皺，具有粘性，不透明，邊緣呈乳白色，菌落中間呈現粉紅色。滴加酸性汞試劑后，在菌落周圍可見明顯透明水解圈，透明水解圈直徑與菌落直徑之比約為3.1∶1。光學顯微鏡下觀察，該菌為革蘭氏陰性菌，菌的大小約0.5 μm×（0.5 ～ 1.0）μm，周身鞭毛，能運動，無莢膜，無芽胞。

2.3.2 生理生化鑒定 菌株Col-C的生理生化鑒定結果見表1。根據形態學及生理生化培養特性比較，參考《常見細菌系統鑒定手冊》，將菌株Col-C初步鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescen）。

表1 菌株Col-C的生化培養特性鑒定結果

2.3.3 16S rDNA的擴增和序列分析驗 采用16S rDNA特異引物對菌株Col-C的總DNA進行PCR擴增，得到約1.5 kb的單一擴增產物，結果見圖2。經T載體克隆，進行序列測定。結果表明，擴增片段長1507 bp，具有典型的16S rDNA特征。采用Blasting，將該序列與GenBank的核酸數據進行同源性比對。結果表明，比對擊中近10條同源率高的序列，該序列與粘質沙雷氏菌（Serratia marcescen）16S rDNA同源性為99%。因此，將此具有膠原蛋白酶活性的菌株Col-C鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescen）。

圖2 菌株Col-C 16S rDNA的PCR產物電泳圖

3 討論

皮革蛋白粉飼料，是以制革工業的廢料（鉻革渣）為原料，經過水解與脫鉻及熟化、干燥、粉碎等工藝加工而成的一種高蛋白質飼料（趙玉蓉等，2003）。在飼料中適量添加可以替代部分魚粉用于節省飼養成本（付京花和唐雪蓮，2011）。目前，國內已有報道應用于育肥豬 （仔豬）（黃國發和邸平勝，2006；邸平勝和白生貴，2006；王九峰等，1998）、蛋雞（范貽洋，1989；張修全，1987）和草魚（趙玉蓉等，2003）等的飼養中。但由于膠原蛋白為硬蛋白，動物消化道難以真正做到有效消化吸收。因此，如果添加適量膠原蛋白酶，一方面可以解決膠原蛋白有效消化的問題，還可以適當增加皮革蛋白在飼料中的添加量，進一步降低飼料成本。

膠原蛋白酶可通過動物內臟提取或微生物發酵獲得。由于微生物來源的膠原酶較動物膠原酶作用底物廣、對底物作用位點多、可通過發酵大量獲得等優點，而動物膠原酶含量少、成本高、不易提取，因而研發微生物來源的膠原酶具有現實意義。本文從土壤中篩選到的粘質沙雷氏菌（Serratia marcescen）天然酶活為21.19U/mL，具有較高的研究價值。

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