辣椒棗試管苗葉片再生植株研究

肖 蓉，王國平，李春燕，張擁兵

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太谷 030815）

棗樹全身是寶，是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。針對(duì)棗特有的花蕾小、去雄困難及胚敗育嚴(yán)重等特點(diǎn)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，加速培育優(yōu)良棗新品種意義非凡。而在現(xiàn)代生物技術(shù)的研究與應(yīng)用中，離體葉片再生技術(shù)是果樹細(xì)胞水平的誘變育種、變異篩選、嵌合體分離及基因轉(zhuǎn)移等方面的基礎(chǔ)[1-2]。因此，對(duì)不同基因型的棗品種建立高效穩(wěn)定的棗葉片再生體系在棗育種中尤為重要。由相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道可知，科研工作者已建立了民勤小棗[3]、梨棗[4]、沾化冬棗[5]、駿棗[6]、雞心棗[7]等棗品種的葉片再生體系，但還未見關(guān)于辣椒棗葉片再生的報(bào)道。

本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以辣椒棗為試材，對(duì)影響其葉片再生的一些因素進(jìn)行研究，旨在確定辣椒棗葉片再生的最佳條件，建立高效穩(wěn)定的辣椒棗葉片再生體系。

1 材料和方法

1.1 材料

外植體：辣椒棗試管苗葉片，苗齡35 d，采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果樹生物技術(shù)研究室。

培養(yǎng)基：1/2 MS（大）、MS和WPM共3種基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度的TDZ，IBA和糖。

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究選用L9（34）設(shè)計(jì)，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，確定基本培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ和IBA、糖4個(gè)參試因素，每個(gè)因素3水平，研究分析不同因素在不同水平條件下對(duì)辣椒棗試管苗葉片再生植株的影響（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.2 試驗(yàn)方法 剪取辣椒棗試管苗從葉尖往下數(shù)的第3，4，5片葉子，在葉上垂直于葉脈方向用手術(shù)刀劃傷，然后接種于培養(yǎng)基上。每瓶放置6片葉，其中，3片葉片正面接觸培養(yǎng)基（反放），另外3片葉片背面接觸培養(yǎng)基（正放）。試驗(yàn)共9組培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基分裝10瓶，其中，5瓶在溫度為（25±2）℃的培養(yǎng)室內(nèi)先暗培養(yǎng)14 d，再在光照12～16 h/d，光照強(qiáng)度3 000 lx左右，濕度為60%～70%的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)；另外5瓶則不經(jīng)過暗培養(yǎng)，直接在光下培養(yǎng)。培養(yǎng)28 d后調(diào)查出愈情況和褐化情況，并將外植體轉(zhuǎn)入MS＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L＋GA30.05 mg/L培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)不定芽再生；培養(yǎng)60 d后調(diào)查不定芽再生數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

出愈率＝（分化愈傷葉塊數(shù)/接入葉塊數(shù)）×100%；

褐化率＝（褐化葉塊數(shù)/接入葉塊數(shù)）×100%；

平均每葉塊不定芽再生數(shù)＝再生芽總數(shù)/接入葉塊數(shù)。

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)葉片再生的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，先暗培養(yǎng)、再光培養(yǎng)處理的葉片在經(jīng)過14 d的暗培養(yǎng)后，生成的白色愈傷明顯多于直接光培養(yǎng)處理的葉片。暗處理的葉片整體顏色發(fā)白，而光處理的葉片整體顯綠（圖1，2）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，白色愈傷逐漸轉(zhuǎn)為淡黃色，經(jīng)過暗處理的葉片在培養(yǎng)18 d時(shí)出現(xiàn)了綠色芽點(diǎn)，沒有暗處理的葉片則在培養(yǎng)22 d時(shí)才有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)。

在培養(yǎng)28 d后，不同培養(yǎng)方式對(duì)葉片愈傷及褐化的影響表現(xiàn)得更明顯（表2）。

表2 不同培養(yǎng)方式對(duì)辣椒棗葉片再生的影響

從表2可以看出，2種培養(yǎng)方式相比較，無論是正放還是反放，經(jīng)過暗處理的辣椒棗葉片出愈率均較高，褐化率均較低。從最終的不定芽再生數(shù)來看，有暗處理的葉片較沒有暗處理的葉片高71%（正放）和78%（反放）。盡管統(tǒng)計(jì)分析顯示，各處理結(jié)果間差異未達(dá)到0.05顯著水平，但暗處理有利于辣椒棗葉片再生這一點(diǎn)是可以肯定的。

2.2 不同接種方式對(duì)葉片再生的影響

表3是暗培養(yǎng)條件下葉片不同接種方式的處理結(jié)果。從表3可以看出，辣椒棗葉片正放比反放出愈率高，但差異未達(dá)到顯著水平。褐化率正放也比反放高，分別為62%和40%。這可能與葉片結(jié)構(gòu)有關(guān)。葉片結(jié)構(gòu)具有背面葉肉細(xì)胞排列較正面疏松、氣孔數(shù)量較正面多的特點(diǎn)。因此，葉背面與培養(yǎng)基接觸則容易吸收養(yǎng)分，出愈率較高；但所吸收的養(yǎng)分中有些物質(zhì)又是極易導(dǎo)致褐化的。因此，褐化率正放比反放高，最終導(dǎo)致正放的不定芽再生數(shù)低于反放，分別為1.20，1.42個(gè)。

另外，在培養(yǎng)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，辣椒棗的愈傷組織先從葉片背面的葉脈長出，葉片反放有利于愈傷組織及芽點(diǎn)的觀察。故本試驗(yàn)認(rèn)為，辣椒棗葉片再生培養(yǎng)時(shí)，以葉片反放（即葉片背面朝上）為最好。

表3 不同接種方式對(duì)辣椒棗葉片再生的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)葉片再生的影響

2.3.1直觀分析采用L9（34）正交表進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，旨在找出辣椒棗葉片再生的最佳培養(yǎng)基。從表4可直觀地看出，第1個(gè)組合的不定芽再生數(shù)最高，均值達(dá)每葉片5.400 2個(gè)。最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A1B1C1D1。

周瑞金[8]研究得出，葉片在以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，形成愈傷組織較多，不定芽80%是從葉片正面產(chǎn)生；在以WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)，愈傷組織少，葉片褐化重，但不定芽再生數(shù)量多，且不定芽多從葉片背面不經(jīng)過愈傷組織而直接生成，質(zhì)量較高。本試驗(yàn)也有相似現(xiàn)象。從表4可以看出，在7，8，9號(hào)組合中，葉片大多褐化，出愈率為0，但在7號(hào)組合中，葉片最終平均每個(gè)葉片長出0.133 2個(gè)再生芽。但總的來看，第7，8，9號(hào)組合不定芽再生數(shù)大多為0，這表明WPM不適合作為辣椒棗葉片再生的基本培養(yǎng)基。

2.3.2 極差分析 表5是不同因素對(duì)辣椒棗不定芽再生數(shù)影響的極差大小分析。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，調(diào)整后的R值排序?yàn)镽A＞RB＞RD＞RC，則影響不定芽再生數(shù)的因素主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C。根據(jù)各因素水平均值的大小，可得不定芽再生數(shù)最高的培養(yǎng)基組合為A1B1D1C1。

表5 極差分析結(jié)果

2.3.3 方差分析 表6表明，基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽再生數(shù)的影響最大，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），TDZ和糖濃度對(duì)不定芽再生數(shù)也影響顯著（P＜0.05），而IBA對(duì)再生數(shù)的影響不顯著。由F值的大小得出，影響不定芽再生數(shù)的主要因素A＞D＞B＞C。表5中B和D的極差值相差只有0.000 1，綜合極差分析和方差分析，在本試驗(yàn)中4個(gè)因素對(duì)不定芽再生數(shù)的影響大小為A＞D＞B＞C。

表6 方差分析結(jié)果

2.3.4 多重比較 表7是不同處理因子各水平間的多重比較，結(jié)果表明，A因素各水平中，A1相對(duì)于A2，A3對(duì)辣椒棗葉片不定芽再生數(shù)有明顯提高，方差分析達(dá)極顯著水平（P＜0.01），這說明1/2 MS（大）培養(yǎng)基相對(duì)于MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基更有利于辣椒棗葉片再生。B，C，D因素各水平中以B1，C1，D1對(duì)不定芽再生更有利，但它們在0.01水平上差異均未達(dá)顯著水平。

表7 不同處理因子各水平間差異顯著性檢驗(yàn)

綜合直觀分析、極差分析、方差分析和多重比較的結(jié)果，確定辣椒棗組培苗葉片再生的最優(yōu)培養(yǎng)基為A1D1B1C1，即1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋I(xiàn)BA0.1 mg/L＋糖 20 g/L。

3 結(jié)論與討論

辣椒棗葉片再生培養(yǎng)中，適當(dāng)?shù)陌堤幚碛欣诶苯窏椚~片愈傷組織的形成，并能促進(jìn)愈傷組織盡快形成芽點(diǎn)，有利于縮短葉片再生培養(yǎng)時(shí)間。本試驗(yàn)中暗處理時(shí)間為14 d，在今后的研究中還有待進(jìn)一步確定暗處理的最佳時(shí)間。

在有關(guān)棗的葉片再生研究中，何業(yè)華等[9]對(duì)來自日本山形縣和富山縣的普通棗研究發(fā)現(xiàn)，暗處理時(shí)葉片愈傷率達(dá)100%，光照條件下愈傷率僅為10%，葉塊枯死率達(dá)78%，愈傷組織的質(zhì)量減少，顏色加深；暗培養(yǎng)條件能促使葉塊產(chǎn)生較多的不定根，而在光照條件下，未見不定根的發(fā)生。這說明光對(duì)日本山形縣和富山縣的普通棗外植體愈傷組織的形成有阻礙作用，暗處理可以促進(jìn)愈傷組織的發(fā)生。其他研究也發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)較光照培養(yǎng)有利于民勤小棗愈傷組織的誘導(dǎo)[3]，對(duì)防止褐化和促進(jìn)木棗葉片再生也有顯著的效果[10]。

而梁國棟等[11]在誘導(dǎo)駿棗葉片愈傷組織過程中發(fā)現(xiàn)，最適于誘導(dǎo)的條件應(yīng)該是前期光培養(yǎng)后期暗培養(yǎng)；李云等[12]在溫度（25±2）℃、光照時(shí)間12 h/d、光照強(qiáng)度2 000 lx的條件下，將贊皇大棗葉片培養(yǎng)30 d后，由葉背處誘導(dǎo)出了不定根。2種相反的結(jié)果說明，不同基因型的物種在葉片再生時(shí)對(duì)光的需求不同。因此，必須根據(jù)研究試材分別進(jìn)行探索，才能確定其最佳的葉片培養(yǎng)方式。除了對(duì)光的需求不同外，不同基因型物種在葉片再生培養(yǎng)時(shí)所需的放置方式也不一樣。王慧瑜等[7]發(fā)現(xiàn)，雞心棗試管苗葉片以葉背面接觸培養(yǎng)基最易誘導(dǎo)出不定芽；而陳宗禮等[5]則發(fā)現(xiàn)，沾化冬棗葉片背面向上的愈傷組織誘導(dǎo)率比向下的約高出36%左右。在本試驗(yàn)中，葉片正放出愈率高，同時(shí)褐化率也高；葉片反放便于愈傷組織及芽點(diǎn)的觀察，褐化率低，最終的不定芽再生數(shù)高于葉片正放，是辣椒棗葉片再生培養(yǎng)中的最佳放置方式。

本試驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基，TDZ，IBA和糖4個(gè)因子對(duì)辣椒棗葉片再生影響大小排序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基＞糖＞TDZ＞IBA。1/2 MS（大）為最優(yōu)培養(yǎng)基，WPM不適合作為辣椒棗的葉片再生培養(yǎng)基。經(jīng)直觀分析、極差分析、方差分析和多重比較，可以確定辣椒棗組培苗葉片再生的最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋I(xiàn)BA0.1 mg/L＋糖20 g/L，其平均每葉片再生不定芽能達(dá)到5.4個(gè)。

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