鈣衛蛋白、鈣激活蛋白在結直腸腺瘤中的表達及意義①

韓際奧 馬應杰 王水紅 秦寶山 韓麗

(1.鄭州人民醫院消化內科 鄭州 450002; 2.新鄉醫學院研究生處 河南新鄉 453003)

結腸腺瘤是結腸的良性腫瘤性病變,具有癌變潛能，其與結腸癌的關系倍受關注。研究證實大腸癌多起源于腺瘤,腺瘤癌變主要與其組織類型、瘤體大小及上皮異型增生有關。癌變過程是一個多階段、多基因改變的復雜過程，癌變的時間約需5～10年[1]。鈣衛蛋白、鈣激活蛋白在結直腸癌中的表達國內外已有較多報道，但對結直腸腺瘤組織中這2種蛋白的表達情況報道較少。本研究采用免疫組織化學的方法對結直腸腺瘤黏膜組織中鈣衛蛋白、鈣激活蛋白的表達情況進行了檢測，分析它們在2種組織中表達差異及共同表達情況，探討鈣衛蛋白、鈣激活蛋白的表達與結直腸腫瘤發生發展的關系，為結直腸腫瘤的早期診斷、分期及預后等提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2008年11月至2009年11月消化內鏡室行結腸鏡檢查病人患者，共發現結直腸腺瘤61例，其中男31例,女30例。年齡范圍7～82歲,平均46.5歲。全部病例均按結腸鏡檢查常規準備,應用奧林帕斯-240、潘太克斯3500電子結腸鏡進行檢查。腺瘤部位和大小、形態以內鏡下描述為準。其中結腸腺瘤35例,直腸腺瘤26例。內鏡下電切或活檢的結直腸病理組織標本由2位高年資病理醫師進行診斷與分型。腺瘤組織學類型如下:管狀腺瘤33例、混合性腺瘤15例、絨毛狀腺瘤例12例,鋸齒狀腺瘤1例。其中非不典型增生36例,不典型增生22例,早期癌變3例。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 組織標本均常規經10%中性福爾馬林溶液固定,酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,做4μm連續切片。每例取8張連續切片,其中2張用于HE染色進行病理分型,其余6張分別用于鈣衛蛋白和鈣激活蛋白免疫組化染色。

1.2.2 主要組化試劑及方法 羊抗人鈣激活蛋白多克隆抗體(Santa Cruz公司,美國)，SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物)免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。免疫組化采用SABC法進行。鼠抗人鈣衛蛋白單克隆抗體購自Thermo公司，免疫組化試劑盒購自天津市津脈基因測繪技術有限公司。采取鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色方法(S-P法)檢測鈣衛蛋白的表達。

1.3 Cap43的定量分析及結果判定

鈣衛蛋白結果判定:采取已知的陽性切片作陽性對照，用PBS液代替一抗作為陰性對照。細胞漿或胞膜染色強度判定:不著色(-);淺棕黃色(+);棕黃色(++);棕褐色(+++)。+ — +++細胞數＞15%為陽性表達,＜15%為陰性表達。

鈣激活蛋白結果判定:陽性對照采用鈣激活蛋白高表達的小鼠腎臟作為對照;空白對照用PBS代替特異性一抗。細胞漿或胞膜染色強度判定:不著色(-);淺棕黃色(+);棕黃色(++);棕褐色(+++)。+— +++細胞數＞5%為陽性表達,＜5%為陰性表達。

1.4 統計學處理

用SPSS 11.5軟件包對所得結果進行χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，以P=0.05為檢驗水準。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鈣衛蛋白、鈣激活蛋白在結直腺瘤組織中的表達及與各病理因素之間的關系

鈣衛蛋白的表達與患者性別、腫瘤部位、組織類型無關(P＞0.05)。3種病理異型組織的表達差異存在差異，非癌變組(非不典型增生加不典型增生)陽性表達率要明顯低于癌變組，但其差異無統計學意義(χ2=5.539，P=0.063)。鈣激活蛋白的表達同樣與患者性別、腫瘤部位、組織類型無關(P＞0.05)。但不同病理異型性組織的鈣激活蛋白表達率之間的差異具有統計學意義(χ2=7.882，P=0.019)，與非不典型增生和不典型增生組織相比較，早期癌變組織鈣激活蛋白表達率明顯降低,見表1。

2.2 鈣衛蛋白、鈣激活蛋白表達之間的關聯性

對同一組織標本同時進行鈣激活蛋白及鈣衛蛋白的表達情況分布如表2所示。統計顯示2種蛋白表達關聯系數r=-0.104，關聯無統計學意義(P=0.425)。

表1 鈣衛蛋白、鈣激活蛋白表達與結直腸腺瘤各病理因素之間的關系[例(%)]

表2 鈣衛蛋白、鈣激活蛋白表達關聯性

3 討論

鈣衛蛋白是中性粒細胞和巨噬細胞胞漿來源的含鈣蛋白，主要來源于中性粒細胞和單核細胞，具有多種生物學功能，在許多炎癥情況下含量增加，可作為急性炎癥性標志物。有研究顯示在結直腸癌中，糞便鈣衛蛋白的含量明顯升高[2]。鈣激活蛋白(calcium actived protein,Cap43)基因又名N-myc下游調節基因,是美國學者Salnikow在研究鎳的致癌機理中發現的新基因[3]。被認為在多種類型的腫瘤中可作為有效的診治指標[4]。在我們的前期研究中對結直腸癌組織中鈣激活蛋白、鈣衛蛋白表達進行檢測發現2種蛋白的表達與結直腸癌患者的性別、部位及癌組織病理類型、分化程度均無關。但2種蛋白在結直腸正常組織、腺瘤組織和癌組織中表達水平存在著明顯差異。鈣激活蛋白在結直腸癌組織的表達顯著低于結直腸正常組織和腺瘤組織,于此相反，鈣衛蛋白在結直腸癌組織的表達顯著高于結直腸正常組織和腺瘤組織,并且其實際表達于結直腸癌組織中的間質細胞，主要位于中性粒細胞的胞質中[5～7]。本次我們檢測對比了結腸腺瘤中2種蛋白的表達，發現2種蛋白的表達與均與結直腸腺瘤患者的性別、部位及組織病理類型無關。但與腺瘤的病理異型性有著密切相關性。發生早期癌變的組織中鈣衛蛋白表達率明顯升高，而鈣激活蛋白表達率顯著下降，這種變化趨勢與它們在結直腸良惡性腫瘤表達的差異是一致的。提示在腺瘤癌變的早期已經出現鈣衛蛋白及鈣激活蛋白表達的異常，鈣衛蛋白的高表達及鈣激活蛋白的低表達可成為早期預測腺瘤癌變的的分子生物學指標。

鈣衛蛋白由兩條重鏈14和一條輕鏈8非共價結合形成異二聚體,每條鏈可結合2個鈣離子,在鈣離子存在的情況下具有抗蛋白酶活性,在腸腔和外界環境中長期保持穩定,不被各種酶和細菌破壞。Salnikow[3]等研究鎳化合物產生cap43過程中發現,游離鈣離子載體A23187刺激cap43基因的大量表達，提示細胞內游離鈣離子升高是誘導cap43基因表達的重要原因。作為同樣與鈣離子相關的蛋白，推測可能存在某種關聯，但我們的研究表明，雖然它們在腺瘤的癌變中表現了相反的變化趨勢，但這種變化不存在關聯性。

[1]陳灝珠等.實用內科學[M].第12版.北京:人民衛生出版社，2005:1934.

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[3]Salnikow K, Blagosklonny MV, Ryan H, et al. Carcinogenic nickel induces genes involved with hypoxic stress[J].Cancer Res,2000,60(1):38～41.

[4]莊利萍，薛喜筠，高倩，等.NDRG1基因與腫瘤的研究進展[J].實用癌癥雜志，2009，24(3):211～212.

[5]秦寶山，馬應杰，王水紅.鈣衛蛋白在大腸癌中的表達及意義[J].胃腸病學和肝臟病學雜志，2010，19(12):1081～1083.

[6]王水紅，馬應杰.大腸癌組織中Cap43蛋白的表達變化及意義[J].山東醫藥，2010，50(6):55～56.

[7]馬應杰,王水紅,韓際奧,等.鈣激活蛋白在結直腸癌及結直腸腺瘤中的表達及意義[J].中華消化雜志，2010，9:624～626.