金黃色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z結構域串聯體的克隆、表達和篩選

萬一，訾靜，張琨，張志敏，張月娟，王琰，王軍

陜西省微生物研究所 分子生物學研究中心，陜西 西安 710043

金黃色葡萄球菌蛋白 A (Staphylococcus aureusprotein A，SpA) 是一種金黃色葡萄球菌胞壁蛋白。天然SpA含有5個高度同源的結構域，分別命名為 E、D、A、B、C (圖 1)，每個結構域都能夠與人及多種哺乳動物如豬、狗、兔、猴、鼠、小鼠及牛等免疫球蛋白G (IgG) 分子中的Fc區相結合，這種結合不會影響IgG抗體Fab片段與抗原特異性結合的能力[1-3]。將這 5個結構域串聯組成的重組SpA與瓊脂糖凝膠偶聯，可制備用于抗體純化的親和填料[4-6]，但由于不同的域結合強度略有差異，導致洗脫條件不均一，經常需要在較低的pH及高濃度的變性劑等相對劇烈的條件下對純化產物進行洗脫，一些抗體經受不了這樣苛刻的洗脫條件而失活[1,7-8]。因此，運用基因工程技術對SpA基因進行改造，采取同型結構域串聯，可以使其具有更好的特異性，能夠避免不同結構域與抗體 Fc段親和性的差異，使洗脫條件溫和而均一[9-10]。

Z結構域是在與IgG結合力較好的B結構域基礎上進行改良，將 Gly定向誘變成為 Ala(圖 1)[11-12]。Z結構域提高了B結構域對CNBr和羥胺的耐受性以及與IgG結合的能力，并降低SpA與Fab片段的相互作用，可作為捕獲IgG的固定化親和配體[10,13-16]。有研究表明，將 Z結構域頭尾相連形成的雙 Z結構域具有較高的穩定性，并且使親和層析中的洗脫條件也更加緩和[17]。因此對Z結構域的研究已成為目前抗體親和介質研究的熱點。

圖1 天然SpA結構以及B結構域定點突變[4,11]Fig. 1 Natural SpA structure and B domain site-directed mutation[4,11]. The SpA shown here is a cell-wall associated protein, consisting of a signal sequence (S) processed during secretion, five homologous IgG-binding domains (E, D,A–C), and a cell-wall attaching structure (XM). Also shown is the Z domain, corresponding to an engineered version of the B domain of SpA.

雖然國內外已有關于 SpA-Z結構域及串聯體的表達、純化等研究報道，如Chen等[18]構建SpA-ZZ原核表達系統，與天然SpA相比，蛋白產量大大提高，降低了重組SpA的生產成本；金慧英等[19]構建 pET-32a-ZZ表達載體，制備SpA-ZZ-Sepharose 4B免疫吸附柱純化人和兔血清IgG，說明SpA-ZZ具有較好的抗體親和性；談珉等[20]制備的重組三聯體 SpA瓊脂糖凝膠對人IgG的吸附載量為25.1 mg/mL；陳校園等[21]制備的重組四聯體SpA瓊脂糖凝膠對人IgG的吸附載量為25 mg/mL。但是Z結構域哪一種串聯體形式更有利于蛋白產量的提高以及抗體的純化目前尚無系統的研究。本研究中，我們構建了不同數目串聯的 Z結構域串聯體，系統比較SpA-Z結構域二串體、三串體、四串體和五串體在原核表達系統中的蛋白產量及其偶聯的親和介質對抗體吸附載量，為獲得更有利于抗體純化的重組蛋白串聯體形式提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

E. coliDH5α，E. coliBL21感受態細胞和pET-22b克隆載體由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑

T4 DNA連接酶、限制性內切酶NdeⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Tiangen公司；咪唑購自西安晶彩生物科技有限公司；人免疫球蛋白購自蘭州生物制品研究所；商品化SpA瓊脂糖凝膠 (Protein A Sepharose CL-4B) 和瓊脂糖凝膠4B (Sepharose 4B) 均購自GE公司；Ni2+親和純化柱購于西安交大保賽生物技術股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 Z結構域串聯體的克隆及表達載體的構建

根據大腸桿菌偏愛密碼子和 Z結構域單體氨基酸序列[10-11,22-23]，從頭設計并合成新的Z結構域單體基因序列，序列兩端是SalⅠ酶切位點，用于基因單體的串聯。先用NdeⅠ/HindⅢ雙酶切將 Z結構域基因單體切下，與經同樣雙酶切的載體pET-22b連接，轉化至E. coliDH5α，篩選具有氨芐青霉素 (Amp) 抗性的轉化子。利用pET-22b載體中測序引物 (表 1) 對菌落進行PCR擴增，鑒定含有Z結構域單體表達載體的菌落。提取陽性克隆的質粒，進行NdeⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，獲得表達載體pET-22b-Z并測序。

將pET-22b-Z質粒以SalⅠ酶切，回收單體片段后先自連 1 h，再與經同樣酶切處理的pET-22b-Z載體大片段連接，轉化至E. coliDH5α。經菌落 PCR、雙酶切鑒定含有二、三、四、五串體表達載體的陽性克隆并測序，最終獲得正確的二-五串體的表達載體，分別命名為pET-22b-ZZ 、 pET-22b-ZⅢ 、 pET-22b-ZⅣ 和pET-22b-Z (Ⅴ圖2)。將上述表達載體分別轉化至E. coliBL21，獲得相應的基因工程菌。

表1 陽性克隆PCR擴增使用引物Table 1 Primer sequences for PCR amplification of the positive clones

圖2 Z結構域串聯體構建Fig. 2 Construction of tandem repeats of the Z domain.

1.2.2 重組 Z結構域單體及二-五串體蛋白誘導表達和純化

將重組 Z結構域單體及二-五串體工程菌株分別接入 LB 培養基 (100 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養4 h，加入乳糖 (終濃度為0.5%，W/V)繼續振蕩 4 h誘導蛋白表達，離心收集菌體沉淀。收集的菌體用 PBS溶液重懸，超聲破碎細胞20 min，離心收集上清，用Ni2+親和層析柱純化。用PBS沖洗填料至平衡，將蛋白樣品流經填料，先用含20 mmol/L咪唑的PBS洗脫雜質，再用含200 mmol/L咪唑的PBS洗脫目的蛋白，純化的目標蛋白對水透析后凍干保存。15%SDS-PAGE電泳后凝膠掃描對蛋白進行純度鑒定。以上純化實驗重復4次。

1.2.3 重組二-五串體蛋白瓊脂糖凝膠的制備

在裝有 4 ℃冰水浴的反應瓶中加入經去離子水洗滌的Sepharose 4B，加入等體積的2 mol/L碳酸鹽溶液 (pH 10.9)，攪拌一段時間，讓瓶內反應物冷至4 ℃。一次性加入CNBr-乙腈溶液 (每毫升凝膠加 CNBr 100~300 mg)，攪拌10~15 min。快速用砂芯漏斗過濾，用冷的去離子水洗到中性，得到活化的Sepharose 4B。將活化好的Sepharose 4B裝入小三角瓶內，加入等體積的0.1 mol/L碳酸鹽緩沖溶液，攪拌下加入配基 (二-五串體蛋白，加入量為 20 mg/mL活化微球)，4 ℃冰水浴下反應24 h。反應終止后，以1 mol/L NaCl溶液洗去未偶聯的配基，去離子水洗至中性，乙醇洗2次，再用水洗，得到重組 SpA-Z結構域串聯體偶聯的瓊脂糖凝膠。

1.2.4 重組二-五串體蛋白凝膠親和介質對人血清吸附試驗

1.2.5 結果計算及統計學分析

摩爾蛋白吸附載量按以下公式計算：

對于多次重復試驗數據以均數±標準誤差(±s) 形式表達，應用 SPSS13.0軟件分析，采用t檢驗比較組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Z結構域單體及二-五串體表達載體的構建

以含有Z結構域基因單體、二串體、三串體、四串體和五串體質粒DNA的陽性克隆為模板，利用 pET-22b載體測序引物進行 PCR擴增，PCR擴增理論值分別為382 bp、556 bp、730 bp、904 bp、1 078 bp，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分別在相應處有顯著條帶 (圖 3A)，與擴增產物大小的理論值一致。對陽性克隆質粒進行NdeⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，目的片段大小理論值分別為 180 bp、354 bp、528 bp、702 bp、876 bp，酶切產物經電泳鑒定，分別在相應處有顯著條帶(圖3B)，與目的基因理論值相一致。測序結果顯示克隆結果正確，最終獲得Z結構域基因單體及二-五串體表達載體。

圖3 Z結構域單體和二-五串體載體的構建Fig. 3 Construction and restriction analysis of vectors of monomer and two-five tandem repeats. (A) Monomer and two-five tandem repeats PCR amplificaion. M： DNA marker (DL 2 000); 1?5： monomer, two, three, four and five tandem repeats PCR products. (B) Restriction analysis of plasmids of monomer and two-five tandem repeats. M： DNA marker (DL 2 000); 1?5： plasmids of monomer, two, three, four and five tandem repeats digested with NdeⅠ and Hind Ⅲ.

2.2 重組Z結構域單體及二-五串體蛋白表達和純化

乳糖誘導 Z結構域單體及二-五串體蛋白表達，目的蛋白分子量理論值分別為 8.3 kDa、14.9 kDa、21.6 kDa、28.2 kDa、34.8 kDa，經SDS-PAGE分析顯示，相應處的條帶明顯增強(圖 4)，該蛋白條帶的分子量與理論分子量相一致，初步判定重組蛋白獲得大量表達。將工程菌超聲破碎后，SDS-PAGE顯示目的蛋白存在于破碎上清中，進一步判定目的蛋白為可溶性表達，破碎后上清液經Ni2+親和柱純化，凝膠掃描洗脫后的蛋白純度大于90% (圖5A，B，C)。

2.3 重組Z結構域單體及二-五串體蛋白產量比較

將純化后的重組蛋白冷凍干燥，獲得的蛋白凍干粉產量如表2所示，其中，四串體和五串體蛋白產量相近，分別為160.0 mg/10 g濕菌體和152.3 mg/10 g濕菌體，是單體蛋白產量的2倍多，與二串體和三串體蛋白產量相比也有明顯增高。說明適當增加 Z結構域基因單體的串聯數，能夠有效提高重組蛋白產量，降低重組蛋白的生產成本。

圖4 Z結構域單體和二-五串體蛋白表達Fig. 4 Expression of the proteins with monomer and two-five tandem repeats of the Z domain. M： protein marker; 1： no-induced protein; 2?6： the proteins with monomer, two, three, four and five tandem repeats.

圖5 Z結構域單體和二-五串體蛋白純化Fig. 5 Purification of the proteins with monomer and two-five tandem repeats of the Z domain. (A) Four tandem repeats protein Ni2+ affinity chromatography map. 1： flow-through peak of Ni2+ column; 2： elution peak (20 mmol/L imidazole); 3： elution peak (200 mmol/L imidazole). (B) SDS-PAGE analysis of purification of the protein with four tandem repeats. M： protein marker; 1： flow-through; 2： eluent at 20 mmol/L imidazole; 3： eluent at 200 mmol/L imidazole. (C) SDS-PAGE analysis of the purified proteins with monomer and two-five tandem repeats. M： protein marker; 1?5： the proteins with five, four, three, two tandem repeats and monomer.

表2 Z結構域單體及二-五串體蛋白產量Table 2 Protein yield of monomer and two-five tandem repeats of the Z domain

2.4 重組Z結構域二-五串體蛋白凝膠親和介質對人IgG吸附載量測定

制備的凝膠親和介質用于人IgG吸附載量測定，結果顯示，二-五串體蛋白凝膠親和介質能特異性吸附人IgG，SDS-PAGE結果顯示純化后的抗體重鏈和輕鏈分子量分別為 50 kDa和25 kDa (圖6A，B)。重組蛋白凝膠親和介質對人IgG的吸附載量如表3所示。結果表明，四串體蛋白凝膠親和介質對人IgG的吸附載量最高，達34.4 mg IgG/mL膠，二串體的抗體載量最低，為12.8 mg IgG/mL膠。根據4個串聯體的分子量大小計算出摩爾蛋白吸附量比值為1.0∶2.6∶5.4∶4.9，說明在重組蛋白等摩爾的條件下，四串體和五串體蛋白凝膠介質對抗體的吸附量相近，是二串體和三串體蛋白吸附量的5倍和2倍左右。雖然在相同摩爾數下，四串體和五串體蛋白凝膠介質對抗體的吸附量相近，但是從蛋白產量和抗體吸附載量變化曲線可知 (圖7)，四串體與五串體蛋白產量相當，偶聯后相同質量的四串體吸附量最大。同時，實驗測得商品化 SpA瓊脂糖凝膠親和介

質對人IgG的吸附載量為20.1 mg/mL膠 (GE產品資料顯示每毫升凝膠偶聯的配基為3 mg/mL 膠)。

圖6 四串體蛋白凝膠親和介質對人IgG分離純化Fig. 6 The protein with four tandem repeats Sepharose 4B affinity matrix for purification of human IgG. (A) Human IgG affinity chromatography map. 1： flow-through peak; 2： elution peak. (B) SDS-PAGE analysis of purification of human IgG. M： protein marker; 1： IgG heavy chain (50 kDa) and light chain (25 kDa).

表3 重組蛋白凝膠親和介質對人IgG吸附載量Table 3 Amount of human IgG absorption of recombinant proteins Sepharose 4B affinity matrices

圖7 Z結構域串聯體蛋白產量和吸附載量變化趨勢Fig. 7 Change trend in yield and absorption amount of the proteins with different tandem repeats. n=4.

3 討論

Z結構域因缺少蛋氨酸和甘氨酸，能大大提高配基對CNBr和羥胺的耐受性以及與IgG結合的能力，因此，Z結構域作為抗體親和層析介質的配基，在抗體分離純化中應用十分重要。本研究成功構建了 SpA-Z結構域基因單體及二-五串體基因工程菌，并對目標蛋白進行有效表達和純化。在重組蛋白C末端引入6個組氨酸標簽，通過 Ni2+親和層析一步即可獲得純度較高的目的蛋白，大大簡化了蛋白的純化過程。此外，將純化后的目標蛋白偶聯至 CNBr活化的瓊脂糖凝膠，制備的重組二-五串體蛋白凝膠親和介質可對人IgG進行有效吸附和純化。

本研究通過比較純化的重組Z結構域單體、二-五串體蛋白凍干粉量可知，Z結構域串聯個數的增加，能有效提高重組蛋白產量，其中獲得的四串體和五串體蛋白凍干粉量是單體的 2倍之多，無論從蛋白表達、純化效率以及生產成本來說，都優于其他幾種蛋白串聯體形式。通過系統比較重組二-五串體蛋白凝膠親和介質對人 IgG吸附載量可知，隨著Z結構域串聯個數的增加，摩爾蛋白吸附量亦逐步增高，四串體和五串體的摩爾蛋白吸附量比值 (5.4，4.9) 明顯高于二串體和三串體 (1.0，2.6)，分析其原因：1) 四串體和五串體含有更多的抗體結合域；2) CNBr活化的瓊脂糖載體通過脂肪族氨基與配基偶聯，當小分子量的配基偶聯時，配基偶聯密度較高，較多的功能基團被占據，空間位阻增大，不利于目標抗體與配基的結合[24-27]。此外，五串體蛋白偶聯的凝膠對抗體吸附量低于四串體，分析其原因可能是：一方面，CNBr活化瓊脂糖載體時，由于活化臂短，大分子配基不利于偶聯；另一方面，雖然相同摩爾數的五串體和四串體吸附載量相當(分別為0.15 mg和0.17 mg)，但是單位體積凝膠中偶聯的五串體摩爾濃度 (154.9 nmol) 少于四串體 (208.9 nmol)，因此五串體偶聯的凝膠對抗體的吸附載量低于四串體。分析結果表明雖然四串體與五串體相比，蛋白產量和相同摩爾數蛋白與抗體的吸附載量相差不大，但是在親和介質制備中，若獲得相同吸附載量的凝膠，四串體的蛋白使用量僅為五串體的80%。因此無論是對抗體吸附效率還是使用成本方面，四串體更適合抗體親和介質的制備。

綜上所述，本研究通過系統比較重組Z結構域基因單體、二-五串體蛋白產量，以及重組蛋白凝膠親和介質對人IgG吸附載量，確定了重組四串體具有蛋白產量高、抗體吸附量大、生產成本低等特點，更適合作為配基用于親和層析介質的制備，為抗體純化領域提供一種價格便宜、高效的重組SpA提供依據。

[1]Ghose S, Allen M, Hubbard B, et al. Antibody variable region interactions with protein A：implications for the development of generic purification processes. Biotechonol Bioeng, 2005,92(6)： 665?673.

[2]Li ZH, Yue YY, Li P, et al. Prokaryotic expression ofStaphylococalprotein A and initial study of the affinity. Chin J Shandong Univ： Health Sci, 2009,47(10)： 28?30.

李志會, 岳盈盈, 李鵬, 等. 金黃色葡萄球菌蛋白 A 的原核表達及生物親和特性研究. 山東大學學報： 醫學版, 2009, 47(10)： 28?30.

[3]Richman DD, Cleveland PH, Oxman MN, et al.The binding ofStaphylococcalprotein A by the sera of different animal species. J Immunol, 1982,128(5)： 2300?2305.

[4]Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2007, 848(1)： 40?47.

[5]Linhult M, Gülich S, Hober S. Affinity ligands for industrial protein purification. Protein Pept Lett,2005, 12(4)： 305?310.

[6]Gagnon P. Purification Tools for Monoclonal Antibodies. Tucson, AZ： Validated Biosystems,1996： 155?158.

[7]Pang SK, Liang H, Song S L, et al. Activity mechanisms and modern application ofStaphylococcusprotein A. Chin Chem Life, 2008,28(6)： 748?751.

逢少堃, 梁浩, 宋淑亮, 等. 葡萄球菌蛋白 A 活性機制與現代應用. 生命的化學, 2008, 28(6)：748?751.

[8]Li RX, Dowd V, Stewart DJ, et al. Design,synthesis, and application of a protein A mimetic.Nat Biotechnol, 1998, 16(2)： 190?195.

[9]Bottomley SP, Sutton BJ, Gore MG. Elution of human IgG from affinity columns containing immobilised variants of protein A. J Immunol Methods, 1995, 182(2)： 185?192.

[10]Gülich S, Uhlén M, Hober S. Protein engineering of an IgG-binding domain allows milder elution conditions during affinity chromatography. J Biotechnol, 2000, 76(2/3)： 233?244.

[11]Nilsson B, Moks T, Jansson B, et al. A synthetic IgG-binding domain based onStaphylococcalprotein A. Protein Eng, 1987, 1(2)： 107?113.

[12]Nilsson B, Forsberg G, Moks T, et al. Fusion proteins in biothechnology and structural biology.Curr Opin Biotechnol, 1992, 2(4)： 569?575.

[13]Graille M, Stura EA, Corper AL, et al. Crystal structure of aStaphylococcus aureusprotein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody： structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(10)：5399?5404.

[14]Linhult M, Gülich S, Gr?slund T, et al. Improving the tolerance of a protein A analogue to repeated alkaline exposures using a bypass mutagenesis approach. Proteins, 2004, 55(2)： 407?416.

[15]Tashiro M, Montelione GT. Structures of bacterial immunoglobulin-binding domains and their complexes with immunoglobulins. Curr Opin Struct Biol,1995, 5(4)： 471?481.

[16]Braisted AC, Wells JA. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci USA,1996, 93(12)： 5688?5692.

[17]Ljungquist C, Jansson B, Moks T, et al.Thiol-directed immobilization of recombinant IgG-binding receptors. Eur J Biochem, 1989,186(3)： 557?561.

[18]Chen C, Huang QL, Jiang SH, et al. Immobilized protein ZZ, an affinity tool for immunoglobulin isolation and immunological experimentation.Biotechnol Appl Biochem, 2006, 45(Pt 2)： 87?92.

[19]Jin HY, Tang ZH. Cloning, expression and purification ofStaphylococcalprotein A antibody-binding ftraction gene. Chin J Biochem Pharm, 2009, 30(1)： 38?40.

金慧英, 唐治華. 葡萄球菌蛋白A抗體結合區基因的克隆、表達和純化. 中國生化藥物雜志,2009, 30(1)： 38?40.

[20]Tan M, Hu H, Guo YJ. Preparation method and application of recombinant protein A gene and expression product： China, CN101050464A.2007-10-10.

談珉, 胡輝, 郭亞軍. 一種重組蛋白 A基因及其表達產物的制備方法和用途： 中國,CN101050464A. 2007-10-10.

[21]Chen XY, Yu BG, Peng T, et al. Construction method and application of artificial recombinant quadruplet protein A： China, CN101298476A.2008-11-05.

陳校園, 余波光, 彭濤, 等. 人工重組的四聯體蛋白 A 及其構建方法與用途： 中國,CN101298476A. 2008-11-05.

[22]Cedergren L, Andersson R, Jansson B, et al.Mutational analysis of the interaction betweenStaphylococcalprotein A and human IgG1. Protein Eng, 1993, 6(4)： 441?448.

[23]Tashiro M, Tejero R, Zimmerman DE, et al.High-resolution solution NMR structure of the Z domain ofStaphylococcalprotein A. J Mol Biol,1997, 272(4)： 573?590.

[24]Jendeberg L, Tashiro M, Tejero R, et al. The mechanism of bindingStaphylococcalprotein A to immunoglobin g does not involve helix unwinding.Biochem, 1996, 35(1)： 22?31.

[25]Kennedy JF, Barnes JA. Assessment of the use of cyanogen bromide-activated sepharose in analytical and preparative immunoadsorption. Int J Biol Macromol, 1980, 2(5)： 289?296.

[26]Huse K, B?hme HJ, Scholz GH. Purification of antibodies by affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods, 2002, 51(3)： 217?231.

[27]Darcy E, Leonard P, Fitzgerald J, et al. Purification of antibodies using affinity chromatography.Methods Mol Biol, 2011, 681： 369?382.