烏鱧魚(yú)卵中胰蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究

歐 雪 ，袁卉華，劉錚兆，吳守亮，顧婷婷，韓曜平

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 2 15500）

蛋白酶抑制劑是一類能抑制蛋白水解酶催化活性的蛋白或多肽[1].蛋白酶抑制劑具有防止生物體內(nèi)不必要的蛋白降解的作用，能調(diào)節(jié)各種蛋白酶的催化活性[2-3].作為自然界中含量最為豐富的蛋白種類之一，蛋白酶抑制劑廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物的組織中[4-6].

研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類組織中存在多種具有生物活性的蛋白及多肽.近年來(lái)，有學(xué)者報(bào)道了來(lái)源于幾種魚(yú)血清[7-8]、肌肉[9-11]和卵中的胰蛋白酶抑制劑[12-14].然而，迄今為止，有關(guān)魚(yú)卵中胰蛋白酶抑制劑的純化研究還比較少.特別是對(duì)于淡水魚(yú)卵中蛋白酶抑制劑的研究在國(guó)內(nèi)尚屬空白.本研究以烏鱧魚(yú)卵為研究材料，利用凝膠層析和發(fā)色底物檢測(cè)等技術(shù)手段從烏鱧魚(yú)卵中分離純化得到了一種胰蛋白酶抑制劑，并進(jìn)一步研究其部分理化性質(zhì)，為淡水魚(yú)卵的高效利用提供理論依據(jù).

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚(yú)為烏鱧（Ophicephalus argus），均采購(gòu)于江蘇省常熟市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，共5條，體重為500～1000 g，體長(zhǎng)300～500 mm，全部為性成熟雌體.

胰蛋白酶（Trypsin），發(fā)色底物N-Benzoyl-L-Arg-4-nitroanilide hydrochloride（B-3133），購(gòu)自Sigma公司；Sephadex G-50凝膠，Sephadex G-75凝膠，購(gòu)自美國(guó)GE（Pharmacia）公司.其他國(guó)產(chǎn)試劑為分析純，符合要求.

試驗(yàn)用主要儀器有冷凍離心機(jī)、成套層析設(shè)備、蛋白電泳儀、紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)等.

1.2 分離純化[15]

1.2.1 卵勻漿液的制備

活體烏鱧魚(yú)用水清洗干凈，魚(yú)體剖腹取卵，用清水沖洗干凈血污，加適量純水后，研磨勻漿，4℃，10000 rpm，離心30 min，收集上清液，制成凍干粉備用.

1.2.2 Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析

用0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）平衡凝膠過(guò)濾柱（2.6×100 cm）；將凍干粉溶解于適量的0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（pH6.0）中，12000 rpm，20 min離心，取上清液用0.45 um濾膜過(guò)濾后上樣于平衡好的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱（100 cm×2.6 cm），用平衡用緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速3 mL/10 min，收集洗脫液，280 nm紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各收集管蛋白或多肽含量，收集活性峰，凍干備用.

1.2.3 Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析

用0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）平衡凝膠過(guò)濾柱（2.6×100 cm）；將Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析得到的活性峰凍干粉溶于0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）中，12000 rpm，20 min離心，取上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后上樣于平衡好的Sephadex G-75凝膠柱，用平衡用緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速2.6 mL/10 min，收集洗脫液，280 nm紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各收集管蛋白含量，合并各洗脫峰，凍干備用.

1.3 烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)及抑制常數(shù)確定[15]

蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[15]，具體方法如下：在50 mM Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中，于25℃測(cè)定待測(cè)樣品對(duì)胰蛋白酶水解生色底物的抑制影響，將不同濃度的待測(cè)樣品與蛋白酶（終濃度為30 nM 胰蛋白酶）于25℃保溫15 min，加入終濃度為0.3 mM的發(fā)色底物（B-3133）起動(dòng)反應(yīng).連續(xù)3 min于405 nm處監(jiān)測(cè)光吸收的變化.分離純化的每一步均采用胰蛋白酶與發(fā)色底物（B-3133）檢測(cè)抑制劑活性.1單位的酶活由每分鐘釋放的對(duì)硝基苯胺的量來(lái)表示，1單位的抑制作用指對(duì)每分鐘釋放1 nmol的對(duì)硝基苯胺胰蛋白酶活性的抑制.

烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白酶的抑制穩(wěn)定性測(cè)定方法如上.能夠被抑制的蛋白酶分別與反應(yīng)緩沖液、相應(yīng)濃度純化的卵蛋白酶抑制劑于25 ℃保溫，時(shí)間分別為0.5 h、1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h.以無(wú)抑制劑時(shí)的酶活力為100%，計(jì)算剩余酶活力.

按照Dixon的方法[16]測(cè)定純化的烏鱧魚(yú)卵絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白酶的抑制常數(shù)（Ki）[7].簡(jiǎn)單過(guò)程為：不同量純化的烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑溶解于50 mM Tris-HCl緩沖溶液中，分別與一定量的胰蛋白酶（最終濃度為68 nM）于室溫下保溫15分鐘，最后加入酶相對(duì)應(yīng)的發(fā)色底物啟動(dòng)反應(yīng)，于405 nm處監(jiān)測(cè) 5 min內(nèi)吸收值的變化，空白對(duì)照加同抑制劑體積的50 mM Tris-HCl緩沖溶液.抑制常數(shù)按公式Ki=[I]/（V0/V1+1）計(jì)算，其中[I]為烏鱧魚(yú)卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的摩爾濃度，V0為空白對(duì)照（無(wú)抑制劑）反應(yīng)的反應(yīng)速度，V1為加抑制劑時(shí)的反應(yīng)速度.實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值.

1.4 SDS-PAGE電泳及分子量的測(cè)定

分離純化過(guò)程各組分的純度用SDS-PAGE電泳檢測(cè).SDS-PAGE參考汪家政的方法[16]，采用不連續(xù)高pH電泳膠，分離膠濃度為12%，pH8.8；堆積膠濃度為3.9%，pH6.8.SDS-PAGE中，純化的樣品在上樣緩沖液（非還原狀態(tài)）中，100℃處理5 min.凝膠于含0.1%考馬斯亮蘭R-250的甲醇/乙酸/水（3/1/6）中染色.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為上海生化所的分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn).純化樣品分子量用SDS-PAGE電泳測(cè)定.

1.5 烏鱧魚(yú)卵的蛋白酶抑制劑的熱及酸堿穩(wěn)定性[15]

1.5.1 熱穩(wěn)定性

純化的烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑樣品溶液（終濃度45 nM）在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃加熱10 min，取出后立即冷卻，然后按前面1.3檢測(cè)抑制劑活性的方法測(cè)定處理樣品的抑制活性.

1.5.2 酸堿穩(wěn)定性

純化的烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑樣品溶液（終濃度45 nM）與等體積的pH2～11的各種緩沖溶液混合，4℃放置18小時(shí)，然后用0.4 MTris-HCl緩沖溶液，pH7.8調(diào)整抑制劑混合溶液的pH值為7.8并測(cè)定其抑制劑活性.

1.6 蛋白濃度測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定采用BCA（Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸）法（試劑盒，購(gòu)自上海鼎國(guó)生物公司）測(cè)定樣品蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制劑分離純化

烏鱧魚(yú)卵勻漿液經(jīng)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾曲線圖譜見(jiàn)圖1.烏鱧魚(yú)卵勻漿液經(jīng)此步分離得到2個(gè)峰，以B-3133為底物經(jīng)tryspin抑制活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，活性峰為第I峰（箭頭所指）.收集合并活性峰，凍干備用.

合并Sephadex G-50凝膠過(guò)濾的第Ⅰ峰凍干后經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析，所得圖譜見(jiàn)圖2.經(jīng)胰蛋白酶抑制活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ峰（箭頭所指）胰蛋白酶抑制活性最高，收集該峰備用.

圖1 烏鱧魚(yú)卵過(guò)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾洗脫曲線

圖2 Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析所得第Ⅰ峰過(guò)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾洗脫曲線

2.2 SDS-PAGE蛋白電泳

在SDS-PAGE還原與非還原條件下，純化的蛋白酶抑制劑（lane2，lane3）表現(xiàn)出單一條帶，表明該蛋白不含二硫鍵.其表觀分子量分別約為42 kDa，而未通過(guò)Sephadex G-50的樣品（lane4，lane5）條帶較多（見(jiàn)圖3）.表明達(dá)到了很好的分離效果.

2.3 烏鱧魚(yú)卵絲氨酸蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)及抑制常數(shù)的確定

從圖4可以看出，純化的烏鱧魚(yú)卵提取液的絲氨酸蛋白酶抑制劑能抑制胰蛋白酶水解底物的活性.當(dāng)烏鱧魚(yú)卵提取的抑制劑蛋白濃度約為130 μg/mL（箭頭所指）以上時(shí)，可以抑制95%以上的68 nM濃度的胰蛋白酶的水解活性.

通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按抑制常數(shù)（Ki）公式計(jì)算[15]，純化的烏鱧魚(yú)卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制常數(shù)為30.3 nM.

圖3 分離純化烏鱧卵絲氨酸蛋白酶抑制劑及未純化樣品的SDS-PAGE電泳分析

2.4 烏鱧魚(yú)卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑的熱及酸堿穩(wěn)定性

烏鱧魚(yú)卵提取物的絲氨酸蛋白酶抑制劑熱的穩(wěn)定性檢測(cè)見(jiàn)圖5，從檢測(cè)的數(shù)據(jù)看，在30～100℃溫度處理的條件下，純化的烏鱧魚(yú)卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑能抑制胰蛋白酶對(duì)發(fā)色底物（B-3133）的水解活性，即使溫度高達(dá)100℃，仍能保持75%以上的抑制劑活性.

對(duì)酸堿的穩(wěn)定性檢測(cè)見(jiàn)圖6.在pH2～11處理?xiàng)l件下，純化的烏鱧魚(yú)卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶水解發(fā)色底物（B-3133）的抑制活性幾乎達(dá)到了90%以上.只有在pH值為12時(shí)酶活性才降低到50%.說(shuō)明這種絲氨酸蛋白酶抑制劑具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性.本研究為該種絲氨酸蛋白酶的利用提供了有價(jià)值的信息，也為大規(guī)模分離純化該種抑制劑提供了新思路，即可以通過(guò)加熱及酸堿處理，先期除去部分不耐熱和酸堿的蛋白質(zhì)，使分離純化效率更高.

圖4 魚(yú)卵提取物對(duì)蛋白酶抑制活性檢測(cè)

圖5 溫度對(duì)烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制活性的影響

圖6 pH對(duì)烏鱧魚(yú)卵蛋白酶抑制活性的影響

3 討論

本研究通過(guò)凝膠色譜技術(shù)，從烏鱧魚(yú)卵的勻漿液中得到了表觀分子量大約為42 kDa的絲氨酸蛋白酶抑制劑，該抑制劑對(duì)胰蛋白酶有專一性的抑制作用.對(duì)該抑制劑進(jìn)行的穩(wěn)定性研究表明，該蛋白酶抑制劑在pH2～11時(shí)有比較好的pH穩(wěn)定性和溫度在30～100℃有較好的熱穩(wěn)定性.

目前，有關(guān)魚(yú)卵中蛋白酶抑制劑的研究已有一些報(bào)道[12-14].這些已純化和鑒定的抑制劑基本屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑.對(duì)其理化性質(zhì)尤其是熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的研究將有助于推動(dòng)該類抑制劑的利用.已有研究結(jié)果表明[12-14，17-18]，半胱氨酸蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性在50℃以下；酸堿穩(wěn)定性一般在pH3～10范圍內(nèi).因此，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性高的蛋白酶抑制劑在一些高溫及極度偏酸堿的條件下，如食品加工、臨床用藥等應(yīng)用蛋白酶抑制劑，可避免因環(huán)境條件嚴(yán)酷帶來(lái)的活性喪失.本研究所分離的蛋白酶抑制劑在pH2～11時(shí)有較好的pH穩(wěn)定性和溫度在30～100℃有較好的熱穩(wěn)定性.因此，該抑制劑具有很高的實(shí)用價(jià)值.

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