卡馬西平對(duì)成年癲癇間大鼠海馬齒狀回Brd U／Neu N表達(dá)水平及其對(duì)空間記憶的影響

權(quán)青云 楊嫣華 李宏圖 李 峰 趙曉娟 林芝惠

癲癇間是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的一組臨床癥狀，對(duì)患者及社會(huì)造成較大危害，尤其是對(duì)患者認(rèn)知功能的損害。目前國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)在成年哺乳動(dòng)物，包括人類的整個(gè)生命過程中海馬齒狀回均有新生的神經(jīng)元產(chǎn)生［1］。近年不少報(bào)道關(guān)于癇間性發(fā)作誘導(dǎo)的損傷刺激海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生［2］。抗癲癇間藥是目前控制癲癇間癥狀的最主要的治療方法。雖抗癲癇間藥對(duì)癲癇間后海馬DG新生成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生已有報(bào)道［3］，但這些新生神經(jīng)元與認(rèn)知之間的關(guān)系報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用氯化鋰和匹羅卡品聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠癲癇間持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）模型，通過5－溴脫氧尿核苷（5－bromodeoxyuridine，Brd U）標(biāo)記新生的神經(jīng)細(xì)胞，利用Brd U與神經(jīng)元核性蛋白（Neu N）雙標(biāo)記觀察卡馬西平（Carbamazepine，CBZ）對(duì)海馬齒狀回內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元的情況，同時(shí)利用行為學(xué)分析評(píng)價(jià)大鼠的空間記憶，為進(jìn)一步探討卡馬西平對(duì)癲癇間患者認(rèn)知影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及藥品 氯化鋰、匹羅卡品、Brd U（5 g／支）均購(gòu)自sigma公司；大鼠來源抗Brd U單克隆抗體（100 ug／支）購(gòu)于Santa公司；小鼠來源的Neu N抗體（500 ug／支）購(gòu)于Chemicon公司；生物素化山羊抗大鼠Ig G抗體、生物素化馬抗山羊IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素購(gòu)于sigma公司；Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG（H＋L）（0.5 ml／支）購(gòu)于 molecule probe；Alexa Fluor 488猴抗小鼠IgG（H＋L）抗體（0.5 ml／支）購(gòu)于 molecule probe。

CBZ，商品名：得理多，200 mg／片，北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H11022279。

行為學(xué)分析環(huán)境：安靜的測(cè)試室，燈光、光線均勻，不透明的塑料測(cè)試箱（60 cm×42 cm×37 cm），SONY數(shù)碼攝像機(jī)，3個(gè)尺寸相同，形狀、顏色不同的物體，其中2個(gè)完全相同，體積為大鼠體積的1／2～1倍，重量大于大鼠體重。

1.1.2 動(dòng)物來源及飼養(yǎng)條件 32只Sprague－Dawley（SD）成年雄性大鼠，體重200 g（購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物飼養(yǎng)室12 h光－暗循環(huán)（6：00－18：00），溫度20～25℃，濕度30～60%，食物和水自由攝取。喂養(yǎng)5 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 SE模型制作及分組 腹腔注射氯化鋰（180 mg／kg），20 h后腹腔注射匹羅卡品（30 mg／kg），當(dāng)大鼠癇間性發(fā)作達(dá)Ⅳ級(jí)或Ⅳ級(jí)以上并持續(xù)達(dá)90 min或抽搐致瀕危時(shí)給予腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg／kg終止發(fā)作［4］。發(fā)作級(jí)別按 Racine分級(jí)［5］，癇間性發(fā)作達(dá)到Ⅳ級(jí)或以上，解除癇間性發(fā)作后狀態(tài)良好者視為合格SE模型。正常大鼠以相同容積的0.9%氯化鈉取代氯化鋰、匹羅卡品和苯巴比妥鈉。隨機(jī)分為4小組（正常對(duì)照組，SE組，CBZ組，SE＋CBZ組），每小組各8只大鼠。

1.2.2 藥物用法 于SE后5 h給各大鼠分別灌胃，正常對(duì)照組（蒸餾水，1 ml／200 g），CBZ組（CBZ 120 mg·kg－1·d－1，4 mg／ml，1 ml／200 g）［6］，2次／d，8：00－20：00。于SE后第6 d為各大鼠腹腔注射Brd U（50 mg／kg），共2次，間隔2 h。

1.2.3 行為學(xué)檢測(cè)方法［7］

在處死前3 d各組大鼠每天熟悉適應(yīng)測(cè)試箱45 min，同時(shí)熟悉適應(yīng)空測(cè)試盒5 min，連續(xù)3 d后進(jìn)行測(cè)試。（1）將每只大鼠置于鋪有墊料的測(cè)試盒適應(yīng)1 min；（2）在測(cè)試盒規(guī)定的位置放入2個(gè)完全相同的物體，觀察大鼠探索物體15 min后（熟悉階段），將大鼠放至動(dòng)物房；（3）3 h后將大鼠及兩個(gè)不同的物體（其中1個(gè)是熟悉的物體）同時(shí)再次放入測(cè)試盒，觀察大鼠探索物體15 min（測(cè)試階段）。在測(cè)試過程中整個(gè)過程被攝像機(jī)記錄。觀察每只大鼠探索兩個(gè)物體的累計(jì)時(shí)間及測(cè)試階段探索物體前30 s中探索新物體所占比例，并進(jìn)行分析。大鼠探索物體的主要標(biāo)準(zhǔn)：（1）大鼠的鼻子指向物體的距離必須小于它頭的長(zhǎng)度；（2）大鼠探索物體的過程胡須必須運(yùn)動(dòng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）站在物體上頭向別處張望；（2）身體不經(jīng)意接觸物體；（3）趴在物體上、靠著物體不動(dòng)。在下一個(gè)大鼠測(cè)試前每個(gè)物體和測(cè)試盒均用75%酒精徹底擦洗。

1.2.4 取材 分別給以各組大鼠戊巴比妥鈉（50 mg／kg）過量麻醉后，打開胸腔，由心尖經(jīng)二尖瓣至主動(dòng)脈，0.9%氯化鈉100 ml快速灌注，然后4%多聚甲醛400 ml先快后慢灌注30 min，取腦，4%多聚甲醛后固定2 h，20%蔗糖溶液沉底。冰凍切片機(jī)切片，留取海馬部位連續(xù)冠狀位切片，片厚30μm，每隔5張取一張腦片為一組收集于0.01M磷酸鉀鹽緩沖 生 理 鹽 水 （potassium phosphate－buffered saline，KPBS）中備用。

1.2.5 免疫熒光染色 取各組大鼠的其中1組腦片，（1）行Brd U變性；（2）加大鼠抗Brd U單克隆抗體（1∶500）及小鼠抗 Neu N 單克隆抗體（1∶200）4℃孵育36 h；（3）避光環(huán)境下加山羊抗大鼠（1∶500）及驢抗小鼠（1∶500）熒光二抗室溫下孵育4 h；（4）避光環(huán)境下貼片，50%甘油封片，使用日本OLYMPUS X2100共聚焦顯微鏡觀察照相。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)分析 各組大鼠探索兩個(gè)物體行為的總時(shí)間無明顯差異（P＞0.05）（圖1A）。但是3 h后測(cè)試，對(duì)照組及CBZ＋SE組大鼠在探索物體的前30 s時(shí)間內(nèi)探索新物體的所占比例明顯高于SE組（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 各組大鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元的情況 日本OlympusBX2100共聚焦顯微鏡下（×400倍）觀察發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬DG區(qū)Brd U／NeuN雙陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在顆粒細(xì)胞層，少數(shù)分布在門區(qū)，呈單個(gè)或兩個(gè)，沒有叢集性，細(xì)胞核形態(tài)比較規(guī)則（圖2A）。SE組海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層Brd U／NeuN雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），但是SE＋CBZ組Brd U／NeuN雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與SE組相比明顯增多（P＜0.05）（圖2B）。

圖1 A 各組大鼠探索物體總時(shí)間（s）

圖1 B 各組大鼠探索物體前30 s內(nèi)探索新物體所占比例

圖2 A 各組大鼠齒狀回新生成熟神經(jīng)元情況（×400倍）

圖2 B 各組大鼠平均每只大鼠海馬齒狀回Brd U／Neu N＋細(xì)胞的數(shù)量

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射造模，整個(gè)發(fā)作過程同人類SE相似。在SE后5 h給大鼠灌胃CBZ，發(fā)現(xiàn)CBZ明顯促進(jìn)新生神經(jīng)細(xì)胞存活，并增加新生成熟神經(jīng)元產(chǎn)生，與以往研究結(jié)果大致一致［8］。同時(shí)，從行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CBZ抗癲癇間治療后的SE大鼠空間記憶、學(xué)習(xí)能力明顯改善。而癲癇間大鼠探索新物體與舊物體的時(shí)間各占一半，提示癲癇間大鼠空間記憶能力明顯下降，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［7］。因此，可以推測(cè)CBZ較長(zhǎng)時(shí)間抗癲癇間治療明顯提高新生成熟神經(jīng)元產(chǎn)生，是CBZ改善癲癇間大鼠的空間記憶、學(xué)習(xí)能力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)之一。

目前AEDs癲癇間藥物是臨床治療癲癇的最主要、最有效手段之一，CBZ為三環(huán)類抗驚厥劑，是目前傳統(tǒng)的AEDs之一，臨床應(yīng)用廣泛，對(duì)癲癇間精神運(yùn)動(dòng)性發(fā)作、大發(fā)作、限局性發(fā)作及混合性發(fā)作均有效。由于癲癇間具有不可預(yù)測(cè)性、發(fā)作性、長(zhǎng)期服藥性等特點(diǎn)，不少患者誤認(rèn)為癲癇間發(fā)作只要在發(fā)作期控制即可，對(duì)生命造成的威脅不大，長(zhǎng)期服用較繁瑣，依從性不高。因此，臨床觀察癲癇間患者不正規(guī)抗癲癇間治療癲癇間患者均存在不同程度的智能損害，并且越嚴(yán)重的癲癇間發(fā)作智能損害越嚴(yán)重，這在以往的研究中也已證實(shí)［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在癲癇間后CBZ干預(yù)28 d后發(fā)現(xiàn)新生成熟神經(jīng)元明顯增多，同時(shí)行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)雖然此組大鼠探索物體的累計(jì)時(shí)間與其他組別無明顯差別，但在探索物體30 s時(shí)間內(nèi)探索新物體所占的時(shí)間比例明顯高于SE組，幾乎與正常對(duì)照組相同。對(duì)于這一現(xiàn)象，本研究推測(cè)CBZ可以改善SE大鼠的空間記憶能力。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SE組大鼠自發(fā)性癲癇間發(fā)作頻繁，CBZ干預(yù)SE組大鼠在實(shí)驗(yàn)14 d后幾乎無自發(fā)性癲癇間發(fā)作。這也為臨床上我們發(fā)現(xiàn)癲癇間患者長(zhǎng)時(shí)間服用CBZ，可控制癲癇間發(fā)作，并且有助于改善患者智能提供理論依據(jù)。

盡管我們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間CBZ抗癲癇間干預(yù)治療可以有效控制癲癇間癥狀，增加新生成熟神經(jīng)元的產(chǎn)生，同時(shí)有效改善癲癇間大鼠的空間記憶、學(xué)習(xí)能力。但這些新生成熟神經(jīng)元在改善智能方面的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。正確引導(dǎo)新生神經(jīng)元發(fā)揮正面的、積極的作用將會(huì)為癲癇間患者帶來新的希望。

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3 Jing Chen，Qing Yunguan，F(xiàn)ang Yang，et al.Effects of lamotrigine and topiramate on hippocampal neurogenesis in experimental temporal－lobe epilepsy.Brain research，2010，13（13），270－282.

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8 權(quán)青云，林芝惠，徐曉霞，等.卡馬西平對(duì)匹羅卡品誘導(dǎo)成年癲癇間大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響.卒中與神經(jīng)疾病，2011，18（2）：78－81，92.

9 李茂林，權(quán)青云，林芝惠.不同程度的癇間性發(fā)作對(duì)成年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶影響的研究.腦與神經(jīng)疾病雜志，2010，18（2）：148－151.