8株方斑東風螺病原菌對17種中草藥敏感性測定

賈春紅,李淑芳,林紅英,張繼東

(廣東海洋大學農學院,湛江524088)

細菌性疾病是水產動物養(yǎng)殖中最為常見危害較大的的一類疾病。國內已有副溶血弧菌、哈氏弧菌和創(chuàng)傷弧菌引起魚、蝦、貝等水產動物患病的報道[1]。腐敗希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌也可以引起水產動物發(fā)病，給養(yǎng)殖業(yè)造成經濟損失。目前對上述疾病的防治仍主要依賴抗生素類藥物，但關于希瓦氏菌屬細菌引起疾病的防治報道較少。隨著抗生素等抗菌藥物的使用，一些副作用如耐藥菌株的產生、藥物殘留、微生態(tài)平衡破壞、免疫系統(tǒng)受到抑制等已經顯現(xiàn)[2]。因此，開發(fā)防治水產養(yǎng)殖中細菌性疾病的綠色制劑具有重要意義。為此，依據傳統(tǒng)的中草藥理論研究和實踐，本項研究選取17種中草藥對弧菌及希瓦氏菌地方菌株進行了單味藥物及其兩藥配伍抑菌作用的研究，以期揭示其作用及相互影響，為應用中草藥防治水產動物弧菌病和希瓦氏菌屬細菌引起的細菌性疾病提供理論依據和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 猴耳環(huán)、桉葉、石榴皮等17種中藥，購自湛江市某藥店。

1.1.2 供試菌株及制備 副溶血性弧菌2株、哈氏弧菌1株、創(chuàng)傷弧菌1株、腐敗希瓦氏菌1株、鮑魚希瓦氏菌1株、海藻希瓦氏菌2株共8株，由廣東海洋大學臨床獸醫(yī)實驗室提供。經復壯、純化后，接種到含3.5%NaCl的營養(yǎng)肉湯（pH7.8）中，35℃培養(yǎng) 18～24h，供試。

1.1.3 培養(yǎng)基 3.5%NaCl營養(yǎng)肉湯（pH7.8），3.5%Nacl營養(yǎng)瓊脂（pH7.8），按常規(guī)制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試中草藥的制備 采用煎煮法[3]。分別稱取各種中草藥各20g，加水200ml，浸泡30～60min，文火煎煮2次，每次30 min，然后過濾藥液；將兩次過濾藥液合并，4000r/min離心10 min，濃縮至20mL，制備成濃度為1g/ml的水煎液，121℃高壓滅菌20min，置4℃冰箱備用。

1.2.2 供試中草藥藥物敏感性測定 采用平皿打孔法[4]。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于含3.5%Nacl的營養(yǎng)瓊脂（pH7.8）平板上，然后用直徑6mm的打孔器均勻打洞，每皿4個，去除洞內瓊脂后，將供試藥液加于洞中，以滿而不溢為宜，并作好標記，35℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察結果，測定抑菌圈直徑。重復3次，取平均值記錄結果。結果判定，抑菌圈直徑大于15mm為高度敏感，10～15mm為中度敏感，小于10mm為低度敏感。

1.2.3 中草藥聯(lián)合藥敏試驗 采用平皿打孔法[4]。根據上述藥敏試驗結果，選取供試菌株中度敏感以上的藥物黃芩、石榴皮、蘇木、烏梅、五倍子、大黃、地榆、連翹、秦皮、桉葉和猴耳環(huán)11種中草藥進行聯(lián)合藥敏試驗。具體操作同1.2.2。打孔根據中藥藥物敏感性測定試驗結果確定兩孔距離，然后加入相應的藥液。根據抑菌圖形，判斷兩藥物間是具有協(xié)同作用，還是無關或拮抗作用[5]。

2 結果

2.1 供試中草藥藥物敏感性測定結果五倍子、烏梅、蘇木、猴耳環(huán)對2株副溶血性弧菌、1株哈氏弧菌、1株創(chuàng)傷弧菌、1株腐敗希瓦氏菌、1株鮑魚希瓦氏菌、2株海藻希瓦氏菌8株菌呈高度敏感；大黃、地榆、桉葉對8株菌呈中度敏感；黃芩、石榴皮、連翹、秦皮4種中草藥除分別對一株菌腐敗希瓦氏菌、哈氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌1呈低度敏感外，對其余7株菌均呈中度敏感；石韋、鴨膽子、益智仁、郁金、板藍根、貫眾6種中草藥除石韋對一株海藻希瓦氏菌呈中度敏感外，其余均未見抑菌作用。詳見表1。

表1 供試中草藥對各供試菌株的抑菌圈直徑Tab.1 Results of drug sensitivity of Chinese herbal medicine for the test/mm

2.2 中草藥聯(lián)合藥敏試驗

五倍子與桉葉、烏梅與黃芩對藥組對副溶血性弧菌1表現(xiàn)為協(xié)同；五倍子與黃芩、烏梅與黃芩對藥組對副溶血性弧菌2表現(xiàn)為協(xié)同；烏梅與黃芩、地榆與秦皮對藥組對哈氏弧菌表現(xiàn)為協(xié)同；烏梅與黃芩對藥組對創(chuàng)傷弧菌表現(xiàn)為協(xié)同；烏梅與地榆、蘇木與大黃、蘇木與石榴皮對藥組對腐敗希瓦氏菌表現(xiàn)為協(xié)同；桉葉與黃芩、大黃與黃芩對藥組對鮑魚希瓦氏菌表現(xiàn)為協(xié)同；五倍子與秦皮對藥組對海藻希瓦氏菌2表現(xiàn)為協(xié)同；其余均為相加。詳見表2。

表2 供試中草藥抑菌作用相互作用關系結果Tab.2 Results of associated drug sensitivity Chinese herbal medicine for the test

3 討論

3.1 試驗結果顯示五倍子、烏梅、蘇木、猴耳環(huán)4種中草藥的水煎液對所選供試菌株的體外抑菌作用最好，呈高度敏感；石韋、鴨膽子、益智仁、郁金、板藍根、貫眾6種中草藥抑菌作用較差或未見抑菌作用。五倍子、烏梅、蘇木在弧菌病防治中的應用已多有記載和報道。王玉娥等[6]研究了5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性，結果發(fā)現(xiàn)烏梅、黃連、木瓜、五味子、五倍子對溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌和麥氏弧菌均有很強的抑菌作用；梁利國等[7]在常用中草藥對4種病原弧菌體外抗菌效果的研究中發(fā)現(xiàn)，五倍子、蘇木、地錦草、石榴皮、黃芩、虎杖和山楂等7種中草藥對鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍亂弧菌等4種病原弧菌具有較好的抑菌效果；張曉君等[8]研究發(fā)現(xiàn)哈氏弧菌對地錦草、石韋、虎杖、蘇木、大黃、穿心蓮、黃芩、艾草、五倍子及桑葉高度敏感；童國忠等[9]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮、烏梅、黃連等3種中草藥對大黃魚病原性哈氏弧菌菌株S030901菌株有明顯的抑制作用，五味子、連翹、地榆、黃芩、蒲公英等5種呈微弱抑菌作用；李春遠等[10]研究表明五倍子水提物對副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌呈較高的體外抗菌活性；本試驗結果與這些研究結果一致，說明五倍子、烏梅、蘇木的水煎液具有很好的抑制弧菌的作用，可用其防治這些細菌引起的疾病。本試驗發(fā)現(xiàn)板藍根對哈氏弧菌的抑菌作用與童國忠等[9]報道一致，與張曉君等[8]報道不一致，這可能與分離出來的菌株不一樣有關，也可能與使用的板藍根的產地不同有關。研究表明產地不同的板藍根有效成分及含量，藥理作用強弱等都存在差異[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)石韋對哈氏弧菌的抑菌作用與張曉君等[18]報道不一致，這可能與石韋的種或產地不同有關。李曉丹等[12]報道不同種石韋總黃酮含量存在顯著差異；陳超君等[13]報道廣西不同產地石韋的活性成分存在較大差異。

3.2 中藥配伍是按照病情需要和藥物的藥理作用，將幾味藥合在一起組成復方用于臨床。中藥成分復雜，其治療作用也往往是多方面的，一種中藥當分別和不同的藥物配伍使用時，可突出這種中藥多效能中的某一效能而共同發(fā)揮治療作用[14]。因此，了解中藥之間的相互作用關系，具有很大的意義。本試驗11種中草藥的聯(lián)合藥敏試驗結果顯示，各藥對對2株副溶血性弧菌、1株哈氏弧菌、1株創(chuàng)傷弧菌、1株腐敗希瓦氏菌、1株鮑魚希瓦氏菌、2株海藻希瓦氏菌8株菌相互用中，黃芩和烏梅對2株副溶血性弧菌，哈氏弧菌，創(chuàng)傷弧菌的相互作用都表現(xiàn)為協(xié)同；桉葉和五倍子對副溶血性弧菌1及秦皮與地榆對哈氏弧菌的相互作用也表現(xiàn)為協(xié)同；烏梅與地榆、蘇木與大黃、蘇木與石榴皮對藥組對腐敗希瓦氏菌表現(xiàn)為協(xié)同；桉葉與黃芩、大黃與黃芩對藥組對鮑魚希瓦氏菌表現(xiàn)為協(xié)同；五倍子與秦皮對藥組對海藻希瓦氏菌2表現(xiàn)為協(xié)同；其余均表現(xiàn)為相加。說明各藥物所含成分可能發(fā)生物理和化學的變化，使原有的某些成分發(fā)生轉化或是產生新的化學成分[15]。因此，提示在選用中草藥組織方劑時，要考慮藥物有效成分相互間的影響。

[1]吳后波,潘金培.弧菌屬細菌及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病[J].中國水產科學,2001,8(1):89-93.

[2]楊永仙.抗生素和中草藥在水產養(yǎng)殖疾病防治中的作用[J].養(yǎng)殖技術,2008:17.

[3]吳劍峰.天然藥物化學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:10.

[4]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].上海:上海科學技術出版社,1991:288-289.

[5]程安春,汪銘書,汪開毓,,等.現(xiàn)代禽病診斷和防治全書[M].成都:四川大學出版社,1997:49.

[6]王玉娥,邢晨光,王國良.5種海洋致病弧菌對34種中草藥敏感性的測定[J].水產科學,2008,27(5):221-225.

[7]梁利國,閻斌倫,張曉君,等.常用中草藥對4種病原弧菌體外抗菌效果的研究[J].漁業(yè)科學進展,2010,31(2):114-119.

[8]張曉君,秦國民,閻斌倫,等.病原哈氏弧菌對20種中草藥的敏感性測定及分析[J].江蘇農業(yè)科學,2009,(2):214-216.

[9]童國忠,石亞素,馬劍茵,等.中草藥對海水養(yǎng)殖黃魚病原弧菌抑菌效果研究[J].水產科學,2007,26(8):436-439.

[10]李春遠,鄭紀勇,渠桂榮,等.五倍子對致瀉性海洋弧菌體外抗菌活性的實驗研究[J].中醫(yī)藥學刊,2003,21(8):1256-1257.

[11]巫慶珍,王元梁.南、北板藍根化學成分比較分析[J].海峽藥學,2007,19(10):82-83.

[12]李曉丹,肖婭萍.5種藥用石韋總黃酮的提取及測定[J].中國野生植物資源,2009,28(1):59-61.

[13]陳超君,尹小紅,杜金子,等.廣西不同產地石韋活性成分的分析研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20（9）：2200-2201.

[14]李忠,陳陽春.中藥配伍的規(guī)律和意義[J].山西醫(yī)藥雜志,1978,(4):41-45.

[15]吳笛,劉法錦,廖彩震.中藥配伍對化學成分的影響[J].中成藥,2003,25(2):152-153.