苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學觀察及抗氧化能力變化

曾 婷馮 琳，2，3劉 揚，2，3姜 俊，2，3周小秋，2，3*

(1.四川農業大學動物營養研究所，雅安 625014;2.動物抗病營養四川省重點實驗室，雅安 625014;3.魚類營養與安全生產四川省高校重點實驗室，雅安 625014)

苯丙氨酸(Phe)是魚類的必需氨基酸［1］。目前，有關苯丙氨酸缺乏對魚類影響的研究主要集中在生長性能方面。研究表明，苯丙氨酸缺乏導致印度鯉魚(Cirrhinus mrigala)［2］和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［3］等魚類生長速度降低，飼料利用率和體蛋白質沉積下降。另有研究發現，苯丙氨酸缺乏使異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)的肝胰臟重量降低，肝臟中的脂肪含量升高［4］。而關于魚類缺乏苯丙氨酸的表觀癥狀和病理組織學變化的研究尚未見報道。動物體內的許多物質代謝后會產生羥自由基(·OH)，羥自由基可與蛋白質、核酸等多種大分子物質發生反應，從而影響細胞功能［5］。在犬上的研究發現，苯丙氨酸的苯環可與羥自由基結合形成鄰位－酪氨酸(o-Tyr)、間位－酪氨酸(m-Tyr)和對位－酪氨酸(p-Tyr)3種羥化產物，從而能夠在一定程度上清除羥自由基［6］。因此，苯丙氨酸可能與動物的抗氧化能力有關。本文通過飼喂幼建鯉苯丙氨酸缺乏飼料，旨在研究苯丙氨酸缺乏對幼建鯉組織器官病理變化以及抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼料

選擇平均體重為(7.53±0.01)g的健康幼建鯉［購于通威原(良)種漁場］400尾，隨機分為2組(缺乏組和對照組)，每組4個重復，每個重復50尾魚，組間初始體重差異不顯著(P＞0.05)。試驗飼料是以魚粉(智利進口的白魚粉)、明膠和晶體氨基酸為主要蛋白質源的半純合飼料。除苯丙氨酸外的必需氨基酸組成模擬34%全卵蛋白質模式［7］，不足的必需氨基酸以晶體氨基酸形式添加。缺乏組飼料中苯丙氨酸含量實測值為1.9 g/kg，對照組飼料中苯丙氨酸含量根據預試驗確定的幼建鯉苯丙氨酸需要量設計，實測值為10.9 g/kg。試驗飼 料 中 鋅［8］、鐵［9］、維 生 素 B6［10］、泛 酸［11］、肌

醇［12］、硫胺素［13］和核黃素［14］含量根據本實驗室研究得出的幼建鯉對相應物質的需要量確定，鉀、鈉、碘、硒、維生素D和維生素B12含量參照虹鱒的需要量確定，維生素K含量參照湖鱒的需要量確定，其他營養素的含量參照NRC(1993)鯉魚營養需要量確定。試驗飼料組成及營養水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) g/kg

1.2 飼養管理

將購回的魚苗用氯化鈉(0.8%)、碳酸氫鈉(0.4%)消毒并分組，以重復為單位飼喂于配有自動循環水過濾系統和自動增氧系統的水族箱(90 cm×30 cm×40 cm)中，經4周馴化后開始正式試驗，試驗期為60 d。試驗期間，經生物過濾池過濾后的循環水以1.2 L/min的速度流入水族箱，水溫為(25±2)℃，pH 為 7.0±0.3，溶解氧≥5 mg/L。試驗開始后每15 d用氯化鈉(0.8%)對水體消毒1次。馴化期飼料與試驗期對照組飼料一致，馴化期管理模式和水質條件與試驗期一致。馴化期每天投喂6次，試驗期前期(1～30 d)每天投喂6次，后期(31～60 d)每天投喂4次。

1.3 表觀癥狀及病理組織學觀察

在試驗期間，通過肉眼觀察缺乏組幼建鯉的表觀癥狀，并記錄出現癥狀的時間、尾數以及癥狀情況。試驗結束后，每個重復隨機選5尾魚，分別取腸道(分為前腸、中腸和后腸3段)、肝胰臟、脾臟、鰓絲和肌肉，用100 mL/L的中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅(HE)常規染色，倒置顯微鏡觀察病理組織學變化。

1.4 血清抗氧化指標檢測

試驗結束后，每個重復隨機選6尾魚，饑餓12 h后尾靜脈采血。血液4℃靜置過夜后，于3 000×g、4℃離心10 min取血清，－70℃保存，用于抗氧化指標的測定。血清丙二醛(MDA)和蛋白質羰基含量的測定分別參照Livingstone等［15］和 Armenteros等［16］的方法;抗超氧陰離子能力(A-SAC)和抗羥自由基能力(A-HRC)的測定參照Jiang等［17］的方法;超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定參照 Zhang等［18］的方法;過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性的測定分別參照 Aebi［19］、Lora 等［20］和 Lushchak等［21］的方法;谷胱甘肽(GSH)含量的測定參照 Vardi等［22］的方法。

1.5 數據處理與分析

試驗數據以平均值±標準差表示，用SPSS 17.0軟件對數據進行 t檢驗，P ＜0.05 為差異顯著。

2 結果

2.1 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的表觀癥狀

苯丙氨酸缺乏組魚的眼觀表現為尾鰭向上彎曲(圖1)，開始出現缺乏癥狀的時間為試驗開始后的第5周。60 d的生長試驗結束時，出現缺乏癥的魚有56尾，占缺乏組魚總尾數的28%。

圖1 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鯉的表觀癥狀Fig.1 Clinical symptom of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days

2.2 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學觀察

苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學觀察如圖2所示。前腸、中腸和后腸:缺乏組魚的前腸、中腸和后腸皺襞頂端黏膜上皮出現凝固性壞死，且部分脫落進入腸腔;部分前腸和中腸腸黏膜的固有層輕微水腫，與黏膜上皮之間結構疏松，嚴重者腸黏膜中的毛細血管充血。肝胰臟:缺乏組魚的肝細胞出現大量空泡變性，胞核偏于細胞一側;部分肝細胞腫脹，體積增大;部分胰腺細胞腫脹、體積增大，細胞界限不清，胰腺腺泡中酶原顆粒減少。脾臟:缺乏組魚的脾臟出現含鐵血紅素沉積。肌肉:缺乏組魚的部分肌纖維肌漿凝固，形成無結構的紅染團塊，大量肌纖維出現不同程度的肌漿溶解，嚴重者肌纖維斷裂。后腎:缺乏組魚的后腎腎小球充血，體積腫大，部分腎小管上皮細胞腫脹，管腔輕度變形。鰓絲:缺乏組魚的鰓小片毛細血管擴張充血，嚴重者鰓小片溶解、脫落，軟骨消失。而對照組魚的腸道(前腸、中腸和后腸)、肝胰臟、脾臟、肌肉、后腎和鰓絲的組織結構未見異常。

圖2 苯丙氨酸缺乏(60 d)幼建鯉的病理組織學觀察Fig.2 Histopathological observation of juvenile Jian carp with phenylalanine deficiency for 60 days(400 × )

2.3 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的抗氧化能力變化

由表2可知，與對照組相比，缺乏組幼建鯉的血清MDA和蛋白質羰基含量顯著降低(P＜0.05);血清 A-SAC、A-HRC，SOD、CAT、GSH-Px、GST、GR活性以及GSH含量顯著升高(P＜0.05)。

表2 苯丙氨酸缺乏對幼建鯉血清抗氧化指標的影響Table 2 Effects of phenylalanine deficiency on serum antioxidant indices of juvenile Jian carp

3 討論

3.1 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的表觀癥狀

關于苯丙氨酸缺乏引起魚類骨骼畸形的研究尚未見報道。本試驗結果顯示，當飼料中苯丙氨酸缺乏時，部分幼建鯉出現尾鰭向上彎曲的表觀癥狀。這可能與苯丙氨酸影響了參與骨骼骨化物質的合成有關，有待進一步研究。

3.2 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的病理組織學觀察

腸道是營養物質消化和吸收的主要場所，腸黏膜屏障系統具有阻礙腸腔內細菌入侵和毒素吸收的功能［23］，因此，腸黏膜結構的完整性對于動物機體十分重要。本研究發現，苯丙氨酸缺乏導致幼建鯉的前腸、中腸和后腸腸黏膜上皮細胞壞死、脫落，并且有些腸段出現黏膜毛細血管充血和固有層水腫的現象，表明苯丙氨酸缺乏會影響魚類腸道結構完整性。腸道結構完整性與腸道消化酶和刷狀緣酶活性密切相關［24］。姜維丹等［25］研究發現，肌醇缺乏引起幼建鯉腸黏膜結構完整性受損的同時，消化吸收功能也有所下降。因此，苯丙氨酸缺乏可能通過影響腸道結構完整性來進一步影響腸道的消化吸收功能。在本試驗中，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的胰腺細胞、肝細胞、脾臟、后腎、鰓小片和肌纖維也發生不同程度的病理變化。在異育銀鯽上的研究發現，苯丙氨酸缺乏導致肝胰臟重量下降，肝臟脂肪含量顯著增加［5］。上述結果表明，苯丙氨酸缺乏可能通過影響魚類胰腺和肝臟的組織結構來影響其生長發育和正常功能的發揮，導致消化酶的分泌和營養物質的代謝受到影響。關于苯丙氨酸缺乏對魚類組織器官結構影響的研究尚未見報道。在鼠上的研究顯示，腸道結構和功能與其抗氧化狀態有關［22］。因此，本試驗中苯丙氨酸缺乏導致的幼建鯉組織器官出現病理變化可能與其抗氧化能力降低有關。

3.3 苯丙氨酸缺乏幼建鯉的抗氧化能力變化

MDA是脂質過氧化的主要終產物［26］，MDA含量可以反映機體脂質過氧化損傷的程度;蛋白質羰基是蛋白質氧化的重要標記［27］，蛋白羰基含量可以反映機體蛋白質氧化損傷的程度。本研究發現，當苯丙氨酸缺乏時，幼建鯉的血清MDA和蛋白質羰基含量顯著提高，表明苯丙氨酸缺乏導致魚體的氧化損傷增加。超氧陰離子和羥自由基是2種常見的氧自由基，當其含量超出正常水平時，就會引發機體本身的脂質過氧化以及糖基和蛋白質氧化等氧化應激［6］。本研究發現，與對照組相比，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的血清A-SAC和A-HRC均顯著降低，說明機體對超氧陰離子和羥自由基的清除能力降低。當機體產生自由基時，機體內的抗氧化酶和低分子抗氧化物質則開始參與還原自由基的過程，從而達到解毒的目的［28］。本研究發現，苯丙氨酸缺乏組幼建鯉的血清抗氧化酶活性以及GSH含量均顯著降低，說明苯丙氨酸缺乏時機體中和自由基的能力即解毒能力減弱。苯丙氨酸缺乏引起機體抗氧化能力降低可能是導致內臟器官和肌肉組織病變的原因之一。

4 結論

①苯丙氨酸缺乏可引起幼建鯉尾鰭向上彎曲，組織器官出現不同程度的病理損傷。

②苯丙氨酸缺乏可導致幼建鯉抗氧化能力降低，氧化損傷增加。

［1］BENAKAPPA S，VARGHESE T J.Total aromatic amino acid requirement of the India major carp，Cirrhinus mrigala(Hamilton-buchanan)［J］.The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh，2004，56:129－135.

［2］AHMED I.Dietary total aromatic amino acid requirement and tyrosine replacement value for phenylalanine in Indian major carp:Cirrhinus mrigala(Hamilton)fingerlings［J］. Journal ofApplied Ichthyology，2009，25(6):719－727.

［3］KIM K.Requirement for phenylalanine and replacement value of tyrosine for phenylalanine in rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)［J］. Aquaculture，1993，113:243－250.

［4］馬志英，朱曉鳴，解綬啟，等.異育銀鯽幼魚對飼料苯丙氨酸需求的研究［J］.水生生物學報，2010，34(5):1012－1020.

［5］CUI K，LUO X L，XU K L，et al.Role of oxidative stress in neurodegeneration:recent developments in assay methods for oxidative stress and nutraceutical antioxidants［J］.Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry，2004，28(5):771－799.

［6］SUN J Z，KAUR H，HALLIWELL B，et al.Use of aromatic hydroxylation of phenylalanine to measure production of hydroxyl radical after myocardial ischemia in vivo.Direct evidence for a pathogenetic role of the hydroxyl radicals in myocardial stunning［J］.Circulation Research，1993，73(3):534－549.

［7］CHANCE R E，MERTZ E T，HALVER J E.Nutrition of salmonoid fishes.Isoleucine，leucine，valine and phenylalanine requirements of chinook salmon and interrelationsbetween isoleucine and leucine for growth［J］.The Journal of Nutrition，1964，83:177－185.

［8］TAN L N，FENG L，LIU Y，et al.Growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary zinc［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17(3):338－345.

［9］LING J，FENG L，LIU Y，et al.Effect of dietary iron levels on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:616－624.

［10］HE W，ZHOU X Q，FENG L，et al.Dietary pyridoxine requirement of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15:402－408.

［11］WEN Z P，FENG L，JIANG J，et al.Immune response，disease resistance and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of pantothenic acid［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:430－436.

［12］JIANG W D，FENG L，LIU Y，et al.Growth，digestive capacity and intestinal microflora of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)fed graded levels of dietary inositol［J］.Aquaculture Research，2009，40:955－962.

［13］HUANG H H，FENG L，LIU Y，et al.Effects of dietary thiamin supplement on growth，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2011，17:233－240.

［14］LI W，ZHOU X Q，FENG L，et al.Effect of dietary riboflavin on growth，feed utilization，body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)［J］.Aquaculture Nutrition，2010，16:137－143.

［15］LIVINGSTONE D R，GARCIA M P，MICHEL X，et al.Oxyradical production as a pollution-mediated mechanism of toxicity in the common mussel，Mytilus edulis L.and other molluscs［J］.Functional Ecology，1990，4(3):415－424.

［16］ARMENTEROS M，HEINONEN M，OLLILAINEN V，et al.Analysis of protein carbonyls in meat products by using the DNPH-method，fluorescence spectroscopy and liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry(LC-ESI-MS)［J］.Meat Science，2009，83(1):104－112.

［17］JIANG J，ZHENG T，ZHOU X Q，et al.Influence of glutamine and vitamin E on growth and antioxidant capacity of fish enterocytes［J］.Aquaculture Nutrition，2009，15(4):409－414.

［18］ZHANG X D，ZHU Y F，CAI L S，et al.Effects of fasting on the meat quality and antioxidant defenses of mar-ket-size farmed large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)［J］.Aquaculture，2008，280:136－139.

［19］AEBI H.Catalase in vitro［J］.Methods Enzymology，1984，105:121－127.

［20］LORA J，ALONSO F J，SEGURA J A，et al.Antisense glutaminase inhibition decreases glutathione antioxidant capacity and increases apoptosis in Ehrlich ascitic tumour cells［J］.European Journal of Biochemistry，2004，271:4298－4306.

［21］LUSHCHAK V I，LUSHCHAK L P，MOTA A A，et al.Oxidative stress and antioxidant defenses in gold-fish Carassius auratus during anoxia and reoxygenation［J］.American Journal of Physiology，2001，280:100－107.

［22］VARDI N，PARLAKPINAR H，OZTURK F，et al.Potent protective effect of apricot and β-carotene on methotrexate-induced intestinal oxidative damage in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46(9):3015－3022.

［23］WANG Z R，QIAO S Y，LU W Q，et al.Effects of enzyme supplementation on performance，nutrient digestibility，gastrointestinal morphology，and volatile fatty acid profiles in the hindgut of broilers fed wheatbased diets［J］.Poultry Science，2005，84(6):875－881.

［24］ULLRICH R，ZEITZ M，HEISE W，et al.Small intestinal structure and function in patients infected with human immunodeficiency virus(HIV):evidence for HIV-induced enteropathy［J］.Annals of Internal Medicine，1989，111:15－21.

［25］姜維丹，劉揚，馮琳，等.幼建鯉肌醇缺乏的病理組織學觀察及抗氧化能力和腸道菌群變化［J］.中國獸醫科學，2009，39:64 －69.

［26］REQUENA J R，FU M X，AHMED M U，et al.Lipoxidation products as biomarkers of oxidative damage to proteins during lipid peroxidation reactions［J］.Nephrology Dialysis Transplantation，1996，11(Suppl.5):48 －53.

［27］BALTACIOGLU E，AKALIN F A，ALVER A，et al.Protein carbonyl levels in serum and gingival in patients with chronic periodontitis［J］.Archives of O-ral Biology，2008，53(8):716－722.

［28］SIES H.Glutathione and its role in cellular functions［J］.Free Radical Biology and Medicine，1999，27(9/10):916－921.