胃癌SGC7901/DDP細胞microRNA的表達譜分析及其在耐藥逆轉中的作用

左 靜，陳 勇，劉 穎，高 鴻，劉 巍*

（1.河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北石家莊 050011;2.江蘇省蘇北人民醫院腫瘤內科，江蘇揚州 225001）

胃癌SGC7901/DDP細胞microRNA的表達譜分析及其在耐藥逆轉中的作用

左 靜1，陳 勇2#，劉 穎1，高 鴻1，劉 巍1*

（1.河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北石家莊 050011;2.江蘇省蘇北人民醫院腫瘤內科，江蘇揚州 225001）

目的 分析胃癌SGC7901/DDP細胞 microRNA表達譜及其耐藥特性，研究篩選出的 microRNA-200c對SGC7901/DDP細胞耐藥的影響。方法 采用MTT法檢測細胞的藥物敏感性;應用microRNA芯片進行表達譜分析;運用生物信息學對篩選出的microRNA進行靶點預測和生物學進程分析。采用實時熒光定量RT-PCR檢測microRNA-200c的表達;采用細胞轉染分析microRNA-200c對SGC7901/DDP細胞藥物敏感性的影響。結果 SGC7901/DDP細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50均顯著高于SGC7901細胞（P＜0.05）。與SGC7901細胞相比，SGC7901/DDP細胞中表達上調和下調超過2倍的microRNA分別有5和14個。microRNA高低表達組預測的靶點均廣泛參與信號傳導、細胞周期、分化、凋亡及增殖等生物學進程。實時熒光定量PCR分析證實microRNA-200c在SGC7901/DDP細胞中的表達顯著降低（P＜0.05），microRNA-200c能夠顯著降低SGC7901/DDP細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50（P＜0.05）。結論 SGC7901/DDP細胞的多藥耐藥特性可能與microRNA表達譜的改變有關，其耐藥表型的逆轉可能與microRNA-200c的表達有關。

microRNA;胃癌;耐藥;表達譜

*通信作者（corresponding author）:hebeiliuwei@yahoo.com.cn#與第1作者相同貢獻

microRNA是一類短鏈非編碼RNA。microRNA與腫瘤的診斷、增殖、侵襲轉移、臨床分期及預后等生物學行為密切相關，同時越來越多的證據表明腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性受microRNA的影響。隨著胃癌順鉑耐藥細胞系 （SGC7901/DDP）的建立，對于SGC7901/DDP細胞的研究也逐步開始。雖然已有一些關于其耐藥機制的報道，但是目前對該細胞的microRNA表達譜特征的研究尚未開展，同時microRNA在胃癌順鉑耐藥過程中的作用也沒有進一步的研究。本研究將采用microRNA芯片對SGC7901/DDP進行microRNA表達譜進行分析，對異常表達的microRNA進行高通量篩選，并通過細胞轉染技術觀察芯片篩選出的microRNA-200c對SGC7901/DDP細胞體外藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及細胞培養

胎牛血清，RPMI1640培養液（Gibco公司）;Trizol（Invitrogen公司）;miRCURYTMArray Labelling kit及miRCURYTMArray microarray kit（Exiqon公司）;siPORTMNeoFXTMTransfection Agent、miRNA-200c前體及Negative Control序列（Ambion公司）。人胃癌順鉑耐藥SGC7901/DDP細胞及其親代SGC7901細胞由本室保存。以含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5%CO2的培養箱中常規培養。耐藥細胞培養液中含1 mg/L的順鉑，實驗前1周開始使用常規培養基進行培養。

1.2 MTT法檢測細胞體外的藥物敏感性

貼壁細胞以0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液制備成單細胞懸液，以每孔7×103個細胞接種于96孔培養板中，每孔加入100 μL培養液，細胞貼壁后，加入100 μL不同濃度梯度的順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇。以不加藥物干預作為對照組，以不接種細胞而僅加培養基作為調零孔，每種藥物每個濃度設3個復孔。常規培養48 h后，每孔加新鮮配制的 MTT溶液（5 μg/μL）20 μL，37 ℃、5%CO2下繼續培養4 h后，終止培養，小心吸棄孔內培養上清。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀上測定490 nm波長處各孔的吸光度（A）值，取3個重復孔的平均A值。按以下公式計算細胞的生長抑制率:細胞生長抑制率=（A對照組－A實驗組）/A對照組×100%。根據不同藥物濃度的細胞生長抑制率曲線，計算藥物對細胞的半數抑制濃度（half inhibition concentration，IC50）。

1.3 RNA提取及鑒定

采用Trizol一步法分別提取對數生長期SGC7901/CDDP及SGC7901細胞的總RNA。采用微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA進行1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳（100 V，30 min），檢查18 S和28 S條帶的存在。

1.4 microRNA芯片檢測兩株細胞的microRNA表達譜

應用丹麥Exiqon公司生產的microRNA芯片miRCURYTMLNA Array（v11.0）進行檢測，由上海康成生物工程有限公司代理檢測和分析。分別取1 μg上述兩種細胞樣本的總RNA，采用miRCURYTTMArray labeling kit標記Hy3熒光后應用 miRCURYTMArray microarray kit進行芯片雜交。雜交后芯片進行圖像掃描，所得數據通過原始值減去背景值來做修正，并用中值做標準化，分別計算出兩種樣本中microRNA的標準值及比值。以兩種細胞Hy3熒光標記信號強度的比值≤0.5或≥2為標準判定差異表達microRNA。

1.5 差異表達microRNA的生物信息學分析

應用 TargetScan（http://www.targetscan.org/）及 MicroCosm Targets Version 5（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/）分別進行在線生物信息學分析，篩選出兩種方法預測到的共同的靶點。將所有預測到的靶點按其對應的microRNA表達改變情況分為兩組，分別采用Blast2GO對兩組預測的靶點在線批量GO分析（http://www.blast2go.org/start_blast2go），對不同 microRNA 表達組的靶基因的生物學進程進行注釋，預測其生物學功能。

1.6 實時熒光定量PCR檢測細胞的microRNA-200c表達

提取細胞總RNA，cDNA合成過程中采用microRNA-200c特異莖環引物構建反轉錄體系，反應條件為16℃ 30 min、42℃ 42 min、85℃ 5 min。構建PCR體系進行實時熒光定量PCR擴增，反轉錄及PCR引物序列見表1。反應條件為:95℃，5 min之后進行40個PCR循環，每個循環包括:95℃，10 s;60℃，20 s;72℃，20 s;78℃，20 s（收集熒光強度），內參照為U6。數據分析采用2－△△Ct法進行分析。△Ct=（microRNA-200c）Ct－U6Ct，比較microRNA-200c在兩株細胞間表達的差異時△△Ct=（SGC7901/DDP）△Ct－（SGC7901）△Ct。

1.7 細胞轉染

SGC7901/DDP細胞轉染 microRNA-200c前體（pre-200c）過程，參照 siPORTTMNeoFXTMTransfection Agent使用說明進行。轉染24 h后，提取細胞總RNA;采用實時熒光定量RT-PCR檢測轉染效果;比較轉染后microRNA-200c表達改變時的△△Ct=（pre-200c）△Ct－（Control）△Ct;轉染后24 h收集細胞進行體外藥物敏感性實驗。同時以轉染Negative Control序列作為陰性對照。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 兩株細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的敏感性

SGC7901/DDP細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50均顯著高于SGC7901細胞（P＜0.05）（表2）。

表1 microRNA-200c和U6實時熒光定量PCR所使用的引物序列Table 1 Primers of microRNA-200c and U6 for real-time fluorescent quantitative RT-PCR

表2 SGC7901/DDP及SGC7901細胞的順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇IC50值Table 2 IC50values of the two cell lines to DDP，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel respectively（ ± s，n=3）

表2 SGC7901/DDP及SGC7901細胞的順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇IC50值Table 2 IC50values of the two cell lines to DDP，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel respectively（ ± s，n=3）

*P＜0.05 compared with SGC7901.

group IC50（mg/L）DDP doxorubicin 5-fluorouracil paclitaxel SGC7901/DDP 11.245±0.272* 0.763±0.043* 12.154±2.036* 3.277±0.426*1.528±0.097 SGC7901 2.206±0.256 0.229±0.020 4.481±0.544

2.2 RNA的質量檢測

從SGC7901/DDP及SGC7901細胞提取出RNA的濃度分別為:1 145.77 mg/L和1 853.74 mg/L，A260/A280值均在1.9～2.0之間。其18 S和28 S條帶清晰，亮度比約為1∶2，總RNA純度達到實驗要求且無明顯降解（圖1）。

圖1 兩株細胞的RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 RNA agarose gel electrophoresis of the two cell lines

2.3 microRNA芯片檢測結果

與SGC7901細胞相比，SGC7901/DDP細胞中表達下調超過2倍的microRNA有14個，分別為microRNA-33a，microRNA-200c，microRNA-302c*，microRNA-488，microRNA-148a，microRNA-141，microRNA-212，microRNA-576-3p，microRNA-660，mi croRNA-338-3p，microRNA-24-1*，microRNA-589，microRNA-887，microRNA-22*;表達上調超過2倍的 microRNA有5個，分別為:microRNA-1246，microRNA-943，microRNA-1290，microRNA-516a-5p，microRNA-34b（圖2，3）。

2.4 生物信息學分析結果

TargetScan未能成功預測靶點的microRNA有:microRNA-302c*、microRNA-24-1*和microRNA-22*;MicroCosm未能成功預測靶點的microRNA有:microRNA-1290和microRNA-1246。microRNA表達降低組共有451個預測靶點，Blast2GO分析顯示這些靶點參與信號傳導、轉錄調控、蛋白質磷酸化、跨膜轉運、細胞周期、藥物敏感性、細胞分化、凋亡、增殖、細胞黏附及DNA修復等生物學進程（圖4）。microRNA表達增高組共有98個預測靶點，Blast2GO分析顯示這些靶點參與信號傳導、轉錄調控、跨膜轉運、細胞周期、凋亡、增殖、分化及組織發生等生物學進程（圖5）。

2.5 實時熒光定量PCR分析microRNA-200c在兩株細胞中的表達

SGC7901/DDP細胞 microRNA-200c的△Ct為15.470±0.036，SGC7901細胞的△Ct為14.657±0.229。SGC7901/DDP細胞microRNA-200c的相對表達量是SGC7901細胞的0.573±0.084倍，顯著低于敏感株細胞的表達（P＜0.05），與microRNA芯片結果一致。

圖2 SGC7901細胞及SGC7901/DDP細胞的microRNA芯片雜交圖Fig 2 microRNA microarray maps of SGC7901and SGC7901/DDP cells

2.6 microRNA-200c對SGC7901/DDP體外藥物敏感性的影響

SGC7901/DDP細胞轉染 microRNA-200c前體24 h后 microRNA-200c的△Ct為12.660 ±0.079，陰性對照組為15.493±0.080;microRNA-200c表達水平較對照組提高7.128±0.159倍（P＜0.05）。轉染microRNA-200c前體組細胞對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇的IC50顯著低于陰性對照組 （P＜0.05）（表3）。

圖5 SGC7901/DDP細胞中microRNA表達增高組預測靶點的生物學進程分析Fig 5 Biological process analysis of the predicted targets in upregulated microRNA expression group in SGC7901/DDP cells

表3 SGC7901/DDP細胞轉染microRNA-200c前體后對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇IC50值Table 3 IC50values of SGC7901/DDP cells to DDP，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel after transfection of microRNA-200c precursor or negative control（ ± s，n=3）

表3 SGC7901/DDP細胞轉染microRNA-200c前體后對順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇IC50值Table 3 IC50values of SGC7901/DDP cells to DDP，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel after transfection of microRNA-200c precursor or negative control（ ± s，n=3）

*P ＜0.05 compared with negative control.

group IC50（mg/L）DDP doxorubicin 5-fluorouracil paclitaxel SGC7901/DDP precursor 7.518±0.186* 0.381±0.053* 7.267±0.090* 1.705±0.332*1.534±0.598 3.140±0.403 negative control 12.180±0.294 0.721±0.034 1

3 討論

microRNA是一類主要以調控mRNA表達和翻譯方式發揮作用的短鏈非編碼RNA。microRNA不僅廣泛參與腫瘤的發生發展過程，它還影響著腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。

SGC7901/DDP細胞是胃癌細胞的耐藥株，本研究發現SGC7901/DDP細胞除對順鉑耐藥外，還對阿霉素、5-氟脲嘧啶及紫杉醇存在交叉耐藥，呈現出多藥耐藥特點。目前在乳腺癌、胃癌、卵巢癌耐藥細胞中陸續建立了microRNA表達譜特征［1－3］，但還沒有對SGC7901/DDP細胞microRNA表達譜進行研究，本研究通過microRNA芯片分析共篩選出19個異常表達的microRNA。隨后通過目前常用的靶點預測軟件，進行靶點功能預測及GO分析，結果顯示這些靶點廣泛參與多種生物學進程，表明胃癌細胞順鉑耐藥是多個microRNA綜合作用的結果。

在篩選出的microRNA中，只有少部分的microRNA與腫瘤耐藥的聯系得到研究。其中microRNA-148a不僅能夠增加前列腺癌耐藥細胞對紫杉醇的敏感性［4］，還能夠增加食管腺癌及鱗癌細胞對順鉑和5-氟脲嘧啶的細胞毒作用［5］。對 microRNA-200c的研究顯示其在多種腫瘤耐藥細胞（順鉑耐藥的乳腺癌細胞、吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞）中表達下降［6－7］，它可直接調控 TUBB3 和 ERRFI-1 蛋白的表達增加腫瘤細胞對紫杉醇和表皮生長因子抑制劑的敏感性［8－9］，同時還能夠增加阿霉素的抗腫瘤作用［10］。目前，尚沒有證據顯示其他microRNA直接參與腫瘤耐藥，但是它們的一些靶點如HMGB1（microRNA-141的靶點）和ABCA1（microRNA-33a的靶點）均與腫瘤的耐藥密切相關。因此這些異常表達的microRNA在胃癌細胞耐藥中的作用有待于廣泛的研究。

本研究對表達異常的microRNA-200c進行了進一步的研究。實時熒光定量PCR分析結果與microRNA芯片結果一致，microRNA-200c在SGC7901/DDP細胞中的表達水平顯著下調。進一步研究發現上調microRNA-200c表達后，SGC7901/DDP細胞對4種化療藥的藥物敏感性均顯著增加，然而其中的作用機制還未得到闡述。由于與microRNA-200c密切相關的一些蛋白（如E-鈣黏蛋白）及細胞表型（如上皮間質轉變）均與腫瘤耐藥密切相關［11－12］，因此microRNA-200c的作用機制還需要進一步的研究。

隨著研究的深入，microRNA在腫瘤耐藥中作用也將逐漸闡明。本研究篩選出了SGC7901/DDP細胞中多條表達改變的microRNA，并發現microRNA-200c的化療增敏作用，為下一步研究microRNA的調控機制奠定了基礎。

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Microarray analysis of microRNA expression profile and its role in reversing drug resistance in gastric cancer cell line SGC7901/DDP

ZUO Jing，CHEN Yong#，LIU Ying，GAO Hong，LIU Wei*

（1.Dept.of Medical Oncology Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011;2.Dept.of Medical Oncology Subei Hospital，Yangzhou 225001，China）

ObjectiveTo analyze the microRNA expression profile and drug resistance characteristic and explore the roles of microRNA-200c on drug resistance in gastric cancer cell line SGC7901/DDP.MethodsDrug sensitivity of SGC7901/DDP and SGC7901 cells were tested by means of MTT assay.microRNA array was used to analyze microRNA expression profile，and bioinformatics analysis was used to predict potential targets and biological functions of differentially expressed microRNAs.Real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to validate the result of microRNA-200c expression change from microRNA array analysis.And the effects of microRNA-200c on drug resistance were also analyzed in SGC7901/DDP cells by means of cell transfection.ResultsThe IC50of cisplatin，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel were significantly higher in SGC 7 9 0 1/DDP cells than that in SGC7901 cells（P＜0.05）.Compared with SGC7901 cells，5 microRNAs were upregulated more than 2-fold，and 14 microRNAs were downregulated more than 2-fold in SGC7901/DDP cells.The predicted targets in both downregulated and upregulated microRNA expression group were involved in the biological processes of signal transduction，cell cycle，cell differentiation，apoptosis，proliferation and etc.microRNA-200c was confirmed down expressed in SGC7901/DDP cells by real-time fluorescent quantitative RT-PCR.And SGC7901/DDP cells transfected with microRNA-200c precursor displayed significantly decreased IC50of cisplatin，doxorubicin，5-fluorouracil and paclitaxel（P＜0.05）.ConclusionsChanges of microRNA expression may be related to the multidrug-resistant in SGC7901/DDP cells，and its reversed drug resistance phenotype may be correlate with the microRNA-200c expression.

microRNA;gastric cancer;drug resistance;expression profile

R 735.2

A

1001-6325（2012）01-0042-07

2011－02－24

2011－06－13

河北省醫學科學研究重點課題（20090169）