腺相關(guān)病毒在心臟基因轉(zhuǎn)導中的應用※

劉海燕 袁 洪*

1 劉海燕，碩士研究生，中南大學藥學院，湖南長沙 410013 2 *袁洪，通訊作者，教授，中南大學湘雅三醫(yī)院臨床藥理中心，湖南長沙 410013

目前常用的基因轉(zhuǎn)導的病毒載體主要有慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等。研究表明，腺病毒具有高效的轉(zhuǎn)染率，可有效地感染心肌細胞，但其本身具有免疫源性，且不能使目的基因長期表達，不適合于心臟疾病的基因治療[1]。慢病毒和腺相關(guān)病毒均可使目的基因在靶細胞內(nèi)長期、穩(wěn)定的表達，且免疫源性低，是心臟基因轉(zhuǎn)導的優(yōu)選載體。然而，慢病毒雖可有效地感染體外心肌細胞，但其體內(nèi)的心肌基因轉(zhuǎn)染率不及腺相關(guān)病毒[2]。本文主要概述了腺相關(guān)病毒在心臟基因轉(zhuǎn)導中的應用。

1 腺相關(guān)病毒概述

腺相關(guān)病毒（Adeno Associated Virus，AAV）是一類無包膜的單鏈線性 DNA病毒，外包衣殼蛋白。可分為三個功能區(qū)：開放閱讀框 rep、開放閱讀框cap及兩端145bp長的ITR序列。rep蛋白在病毒整合、復制、包裝中起著重要作用；cap蛋白是包裝成完整病毒所需的衣殼蛋白；ITR是復制的起始區(qū)，是復制、整合、拯救和包裝所必需的順式作用元件，在將病毒基因整合至宿主染色體上起著關(guān)鍵的作用，AAV偏向于將目的基因整合至人基因組19號染色體q臂的特定位置上[3]。AAV載體中目的基因后端為增強子，前端為強啟動子，通常為CMV啟動子。在構(gòu)建病毒載體的過程中，可以通過選擇合適的啟動子，如心肌特異性啟動子 cTnT等加強構(gòu)建病毒載體的心肌靶向性。

AAV宿主范圍廣，不僅可感染分裂期細胞，對非分裂期細胞（如：神經(jīng)元、肌細胞、造血干細胞等）也較敏感；本身無直接細胞毒性或免疫原性；可使目的基因長期表達。但AAV病毒容量小（＜5kb），基因轉(zhuǎn)染率低，在一定程度上限制了其在臨床上的應用。

2 腺相關(guān)病毒在心臟基因轉(zhuǎn)導中的應用

AAV存在多種血清型，不同的血清型因其衣殼蛋白的序列與空間構(gòu)象不同，具有不同的組織或細胞的侵蝕性。Zincarell等通過小鼠尾靜脈注射AAV1-9血清型病毒，分析9種血清型在體內(nèi)的靶向性（見表 1）。結(jié)果表明，4、6、7、8、9型均可高效地感染心肌組織，感染后的心肌組織熒光強度排序如下：9型＞6型＞8型＞4型＞7型。然而，雖然感染后9型的心肌組織熒光強度高于6型，但9型除在心肌組織表達外，在全身其他多處部位也檢測有很強的熒光表達，對心肌的靶向性不如 6型。因此，較之于AAV9、AAV6更適合心肌基因轉(zhuǎn)染[4,5]。為了提高AAV對心肌的靶向性，人們利用心肌特異性啟動子對AAV進行改造，促使目的基因特異性地在心肌表達。AAV9在體內(nèi)的第一高表達部位是肝，其次是心肌組織（見表1），Prasad等構(gòu)建了含cTnT啟動子的 AAV9病毒，結(jié)果表明，目的基因在心肌組織的表達水平是體內(nèi)第二大高表達部位肝的 640倍，cTnT啟動子可有效地引導目的基因在心肌的特異性表達[6]。

表1 尾靜脈注射AAV1-9后體內(nèi)各組織部位熒光強度

研究表明，AAV可使目的基因在心肌組織長期、穩(wěn)定的表達。通過小鼠尾靜脈注射AAV1-9血清型病毒后，檢測目的基因表達水平發(fā)現(xiàn)，9種血清型均可使目的基因在體內(nèi)長期、穩(wěn)定的表達，以7、9型的目的基因體內(nèi)表達水平最高，其次為1、6、8型，2、3、4、5型表達量最低[4]。對新生4～5天的乳鼠心包注射2.5×1011拷貝數(shù)的AAV1、6、7、8、9血清型病毒，6周后檢測體內(nèi)目的基因表達水平，結(jié)果顯示，該劑量下的所有血清型均可高效地將目的基因?qū)胄募〗M織，且在肝組織中幾乎檢測不到目的基因表達，所有血清型中以AAV9表達水平最高。持續(xù)觀察AAV9在心肌組織中的表達發(fā)現(xiàn)，注射1周后目的基因可達穩(wěn)定，2周后達到高峰，后一直持續(xù)至6周，1年后仍可在心肌組織中檢測到一定的表達水平[7]。

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