乳酸脫氫酶A(ldha)基因的克隆與原核表達

袁 軍，許香雅，沈榕強

(福建農林大學 a.生命科學學院;b.生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室，福州 350002)

乳酸脫氫酶(lactate dehydmgenaLse，LDH)是糖代謝中的主要酶類，可催化生物體內丙酮酸轉化為乳酸，也是腫瘤發生、發展中Warburg效應的重要效應酶。Warburg效應是指腫瘤在發生、發展過程中，能量獲得方式由有氧方式轉化為無氧糖酵解方式的現象。在脊椎動物體內，LDH存在3種亞基［1］，分別為A(或稱M亞基)、B(或稱H亞基)、C。研究表明，減少ldha基因的表達能減少細胞的轉化和顯著地延長腫瘤的形成時間，因此，ldha基因在腫瘤的形成初期和腫瘤的發生過程中扮演著重要角色［2－3］。ldha基因編碼的LHD-A蛋白是腫瘤相關的關鍵調控因子HIF-1α及c-Myc的效應蛋白，它在腫瘤發生、發展中起關鍵作用，由于基因改變和腫瘤低氧癥，許多癌細胞消耗大量的葡萄糖并且通過LDH-A生成乳酸。LDH-A表達水平的變化直接關聯著腫瘤的發展程度［4］。此外，在人體內LDH-A同工酶譜的變化也可從一定程度上反映組織器官的病變，對診斷心腦血管疾病、呼吸道疾病、肝臟疾病、腫瘤等均有重要參考價值。為了得到LDH-A的純蛋白，以便在腫瘤相關通路中進行LDH-A蛋白水平的檢測，并進一步闡明ldha基因作用的分子機理，本文對Hela細胞中的LDH-A蛋白編碼基因進行了克隆，并在E.coli中進行表達研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

本實驗所涉及的菌株見表1，質粒見表2。

表1 本實驗所用到的菌株

表2 本實驗所用到的質粒

1.1.2 主要試劑

限制性內切酶EcoR I和 HindⅢ、Taq酶、T4－DNA連接酶、卡那霉素(Kan)均購自Takara公司。質粒提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技公司。RNA提取試劑TRIzol Reagent購自lnvitrogen公司。反轉錄試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒均購自Tiangen公司。IPTG(異丙基硫代－β－D半乳糖苷)購自Sigma公司。丙烯酰胺和N，N'－亞甲基雙丙烯酰胺為Bio-Rad公司產品。寡核苷酸引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.2 表達載體pET28a(+)－ldha的構建

參照TRIzol(Invitrogen)說明書的方法提取Hela細胞中的總RNA。反轉錄獲得cDNA過程按照反轉錄試劑盒說明書進行。從Genebank獲得ldha基因的全核苷酸序列，使用Primer 5.0軟件設計擴增ldha基因編碼序列所需的引物，F:5’－下劃線部分分別為 EcoR I和HindⅢ的酶切位點。PCR反應體系(25 μL)如下:10×EX Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L－1)1 μL，引物(20 μmol·L－1)各 0.3 μL，模板 1 μL，EX Taq 酶(2.5 U·μL－1)0.2 μL。PCR 反應條件為:95 ℃預變性5 min;94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環32次后72℃延伸5 min。PCR擴增產物及質粒pET28a(+)經純化后，用EcoR I和HindⅢ進行雙酶切，然后用T4-DNA連接酶于16℃進行連接，連接產物轉入大腸桿菌BL21(DE3)。涂布于LB+Kan平板上，37℃恒溫培養箱培養12 h，挑取單菌落接種于4 mL LB+Kan培養基中，于 37℃ 180 r·min－1搖床培養16h。挑取陽性克隆做PCR及酶切驗證。將經驗證的陽性克隆子送公司測序后與ldha基因原序列進行同源性比對。序列正確的質粒即為獲得的表達質粒pET28a(+)－ldha。實驗具體操作方法參考《分子克隆實驗指南》［5］。

1.3 重組蛋白的誘導表達

挑取經測序驗證的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)－ldha和 E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)單菌落，分別接種于4 mL含卡那霉素(10 μg/mL)的LB液體培養基中，37℃恒溫搖床振蕩培養過夜。按1%接種量分別將菌體轉接于含相應抗生素的50 mL LB液體培養基中，37℃恒溫振蕩培養至OD600為0.6 ～0.8，加 IPTG 至終濃度 1.0 mmol/L，28℃繼續誘導培養8 h。然后4℃離心1 min(12 000 r·min－1)，棄上清留菌體沉淀，再用 80 μL 5×SDS-PAGE樣品緩沖液重懸，放入100℃沸水煮3 ～5 min 后取出，離心5 min(12 000 r·min－1)，上清液用于SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 ldha基因的克隆

參照TRIzol說明書的方法獲得了Hela細胞的總RNA，提取結果如圖1所示。以RNA反轉錄得到的cDNA作為模板，與合成的引物擴增得到ldha目的基因片段，大小為999 bp(圖2)，與預期大小相符。

圖1 Hela細胞中抽提的總RNA

2.2 表達載體的構建與驗證

PCR產物與載體pET28a(+)具有相同酶切位點，通過酶切與連接，將目的基因ldha構建到了載體pET28a(+)上，形成了表達載體 pET28a(+)－ldha(圖3)。

圖2 ldha基因PCR擴增結果

圖3 pET28a(+)－ldha原核表達載體的構建

將構建好的載體pET28a(+)－ldha轉化為E.coli BL21(DE3)，經培養后，提取質粒做PCR和雙酶切驗證。PCR擴增結果表明，經凝膠電泳檢測得到大小為999 bp的核苷酸片段(圖4)與理論推測一致。用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后檢測得到2條大小分別為5 350 bp和989 bp的核苷酸片段(圖5)，表明ldha基因片段已連接到質粒pET28a(+)上。將陽性克隆子送至生物公司測序，測序結果與ldha原序列用軟件DNAMAN比對兩者的同源性，結果顯示同源性為100%，說明ldha基因已成功插入pET28a(+)載體中，進一步證明了表達載體pET28a(+)－ldha構建成功，可供后續蛋白表達實驗使用。

圖4 重組質粒pET28a(+)－ldha的PCR驗證

圖5 質粒pET28a(+)－ldha酶切驗證

2.3 重組蛋白的誘導表達

分別挑取經驗證正確的陽性克隆子E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)－ldha與空載體對照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)進行誘導表達。培養菌株 OD600達0.6～0.8時將其用1 mmol/L IPTG誘導8 h，離心收集菌體，進行SDS-PAGE蛋白質電泳分析，結果發現，在分子量為36 kDa處有一明顯的蛋白質表達條帶(圖6)，蛋白大小與理論推測值一致，而對照空載菌株則幾乎沒有該蛋白表達條帶，說明該蛋白條帶為LDH-A蛋白表達條帶。

圖6 E.coli BL21(DE3)/pET28A(+)－ldha表達產物SDS-PAGE分析

3 討論

乳酸脫氫酶是以NAD為輔酶，催化生物體內糖代謝過程中乳酸與丙酮酸之間可逆反應的一組同工酶。作為糖酵解途徑中一種重要的酶，它廣泛存在于生物體內，并具有組織器官特異性。乳酸脫氫酶在人體中主要分布于腎、心肌、肝、脾、紅細胞和白細胞等組織或器官中［6］。而腫瘤細胞具有一種獨特的代謝途徑，它的糖酵解進行的順序與三羧酸循環缺少聯系，導致腫瘤細胞利用葡萄糖的量會比正常組織細胞高5～10倍，其中多數轉變成了乳酸鹽。許多腫瘤相關研究表明，患者的發作期，無論初發或復發，其血清LDH水平均較正常明顯增高，患者癌細胞中的LDH顯著高于正常組織［7－8］，可作為代表全身腫瘤細胞負荷的一項重要指標。產生這一現象的原因可能與上述腫瘤細胞的代謝特性有關。但是，目前對于癌基因和糖酵解的關聯還了解甚少，已證明了ldha是c-Myc致癌轉錄因子的直接靶基因［9－10］。此外，腫瘤細胞中低氧癥可誘導因子(HIF－1)能調控LDH-A［11－12］，如敲除或減少 LDH-A 可明顯抑制腫瘤細胞對缺氧的耐受力。接種了敲除或降低LDH-A表達的患癌小鼠，生存時間明顯延長［13］。減少ldha能抑制腫瘤初期的形成及腫瘤細胞的轉移，這是因為在正常組織細胞中既不會含氧低也沒有活化的c-Myc，而在腫瘤細胞中含氧量低［10］。ldha基因表達的減少會誘導氧化應激和腫瘤細胞死亡。

在本實驗中，將ldha基因構建到表達載體pET28a(+)中，得到重組表達載體pET28a(+)－ldha，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)，獲得了重組菌株。在IPTG誘導下，ldha基因在大腸桿菌中得到了成功表達，這為今后LDH-A蛋白的快速檢測，闡明ldha基因在腫瘤發生發展及其他重大疾病中的關鍵作用提供了參考。

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