硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨含量測定

黃志元 朱樣根

（江西珍視明藥業有限公司，江西 撫州 344000）

硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨含量測定

黃志元 朱樣根

（江西珍視明藥業有限公司，江西 撫州 344000）

目的：用高效液相色譜法（HPLC）測定硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨的含量。方法：色譜柱為CN（Hypersil CN，150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.03 mol/L磷酸二氫鈉溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0）-乙腈（57∶43）；流速為2 mL/min；檢測波長為214 nm；柱溫為35℃；苯扎氯銨C12、C14、C16之間的分離度應符合規定。結果：苯扎氯銨在40～160 μg/mL內線性關系良好，Y=12.228 1 X+6.881 4（r=0.999 9，n=6），回收率為99.7%～101.9%，RSD=0.66%。結論：該法操作簡便，快速、準確、靈敏度高，重復性好，可用于硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨的含量測定。

高效液相色譜法；苯扎氯銨；硝酸毛果蕓香堿滴眼液；含量測定

青光眼是全球第二大致盲眼病，是不可逆盲最主要的原因，同時也是我國第二大眼科常見疾病。其治療藥物大致分為前列素類藥物、β腎上腺素受體拮抗藥、腎上腺素受體激動劑、碳酸酐酶抑制劑及縮瞳劑[1]。具有明顯縮瞳作用的硝酸毛果蕓香堿（匹羅卡品）用于治療青光眼，由于其療效確切，使用至今已有上百年歷史[2]。我公司生產的硝酸毛果蕓香堿滴眼液規格為5 mL∶25 mg，屬于多劑量制劑。制劑一旦開封后，容易在使用和保存過程中被淚液和空氣中的微生物污染，從而產生安全性隱患。為了防止硝酸毛果蕓香堿滴眼液在使用或儲存過程中被微生物污染，本品添加了抑菌劑苯扎氯銨。但目前眼用制劑中使用的抑菌劑對眼部均有不同程度的刺激性，如使用過量還會對眼組織產生損害。例如苯扎氯銨可導致眼部炎癥、過敏、纖維化和干眼癥。因此，抑菌劑的合理使用和質量控制是保證眼用制劑安全性、有效性的關鍵問題之一。在篩選抑菌劑用量時應盡量采用抑菌劑的最低有效濃度，保證藥品在使用過程及有效期內符合衛生學要求，同時，最大限度地降低抑菌劑對眼睛的刺激和損害[3]。本研究旨在建立HPLC對硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨含量進行控制，并將該法訂入本品質量標準中。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），ESJ180-4型電子分析天平，7530G紫外可見分光光度計，pHS-3C型酸度計。

1.2 試藥

苯扎氯銨對照品（10%，W/V）：Cat.No.1051001，USP ROCKVILLE，MD Lot.LOD209（C12∶C14∶C16= 68∶25∶5）；硝酸毛果蕓香堿滴眼液（江西珍視明藥業有限公司，批號：090901、060901、060902、060903）；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉均為分析純，乙腈為色譜純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

以氰基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.03 mol/L磷酸二氫鈉溶液 （用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0）-乙腈（57∶43）為流動相，流速：2 mL/min，檢測波長214 nm，柱溫：35℃；苯扎氯銨 C12、C14、C16之間的分離度應符合規定。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密量取苯扎氯銨對照品溶液 （10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻；再精密量2 mL置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每 1 mL含苯扎氯銨80 μg的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 直接以樣品溶液作為供試品溶液。

2.2.3 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 20 μL，注入液相色譜儀，測定，按外標法以苯扎氯銨 C12、C14和 C16（相對保留時間分別約為0.51、0.71和1.00）同系物峰面積之和計算，即得。本品含苯扎氯銨應為0.0064%～0.009 6%。

2.3 方法學研究

參考《糠酸莫米松鼻噴霧劑進口注冊標準》（標準號：JX20080020）項下的苯扎氯銨含量測定方法和美國藥典（USP30）[4]苯扎氯銨的測定方法進行了摸索。發現糠酸莫米松鼻噴霧劑進口注冊標準項下的苯扎氯銨含量測定方法中的流動相在配制過程中存在大量析出結晶的現象，可能是有機相/水相的比例反了，通過實驗調整并確定比例為有機相/水相 =43/57時，同系物的3個峰可以得到較好的分離；而 USP30的色譜條件分離不佳，3個同系物色譜峰難以得到穩定的分離。因為苯扎氯銨為同系物組成的混合物，有多個色譜峰，同時《糠酸莫米松鼻噴霧劑進口注冊標準》項下的苯扎氯銨含量測定方法中未明確流速和柱溫，為了利于快速分析對流速和柱溫進行了優化摸索，選擇了流速為2.0 mL/min，柱溫為：35℃。

2.3.1 測定波長的選擇 取苯扎氯銨對照品溶液于205～295 nm波長范圍內掃描，結果見圖1，僅有末端吸收。參照《糠酸莫米松鼻噴霧劑進口注冊標準》（標準號：JX20080020）項下的苯扎氯銨含量測定方法中的波長214 nm和USP30苯扎氯銨的測定波長 254 nm；取溶劑、按處方去除苯扎氯銨配制的陰性對照溶液和對照品溶液的供試品溶液分別于214 nm和254 nm下進樣，測定，記錄色譜圖。結果顯示，溶劑和陰性對照圖譜對苯扎氯銨的含量測定均沒有干擾；但在254 nm處苯扎氯銨峰面積很小，只有兩位數，其靈敏度（總峰面積/進樣量）為28.5 mAU*S/μg；而在214 nm處的苯扎氯銨峰面積比254 nm處的大很多，達到了4位數，其靈敏度為623 mAU*S/μg，是前者的二十多倍。為了便于定量檢測，減少誤差，所以選擇214 nm作為苯扎氯銨的測定波長。

2.3.2 計算方法的選擇 根據苯扎氯銨對照品（10%，W/V）的標簽說明可以知道其主要同系物組分C12、C14、C16比例依次為68%、25%、5%，因測定方法為反相色譜，因此可以確定對照品色譜圖中同系物的出峰依次為同系物 C12、C14、C16，通過比較制劑中使用的苯扎氯銨原料的色譜圖可以發現其主要同系物組分也是 C12、C14、C16，但是比例不一樣，主要是C12，占到95%以上，C14僅0.5%，C16為4%；滴眼劑樣品中因苯扎氯銨含量較低，C14色譜峰幾乎檢測不到。參照《糠酸莫米松鼻噴霧劑進口注冊標準》（標準號：JX20080020）項下的苯扎氯銨含量測定方法中 “按外標法以苯扎氯銨C12、C14和C16同系物峰面積之和計算”的計算方法，選擇采用按外標法以苯扎氯銨C12、C14和C16同系物峰面積之和計算含量，同時考慮到國內外苯扎氯銨主要同系物組分 C12、C14、C16比例不一致的問題，為了消除比例不一致帶來的投料和測定的誤差，在苯扎氯銨原料按《中國藥典》標準檢查的基礎上增加以苯扎氯銨對照品（USP對照品）為對照的HPLC含量測定，即采用與該制劑一樣的方法，按外標法以苯扎氯銨C12、C14和C16同系物峰面積之和計算測定原料的含量，并以HPLC測定的含量計算生產中苯扎氯銨的投料量。

2.3.3 處方成分的干擾考察

2.3.3.1 按處方量配制除苯扎氯銨外的溶液作為陰性溶液。

2.3.3.2 精密量取苯扎氯銨對照品溶液（10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻；再精密量取2 mL置25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含苯扎氯銨80 μg的溶液作為對照品溶液。

2.3.3.3 直接以樣品溶液作為供試品溶液。分別取上述3種溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明陰性溶液對本品苯扎氯銨含量測定無干擾。結果見圖1。

圖1 硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨HPLC圖

2.3.4 重復性試驗 精密吸取按2.2測定法項下配制的對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續進樣6針，測定其峰面積，RSD為0.17%（n=6）。精密吸取090901批樣品20 μL注入液相色譜儀，連續進樣6針，計算苯扎氯銨的含量，RSD為0.22%（n=6）。

2.3.5 線性試驗 精密量取苯扎氯銨對照品適量，分別稀釋成40、80、100、120、140、160 μg/mL的溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標進行線性回歸得回歸方程為：

Y=12.228 1 X+6.881 4（r=0.999 9，n=6），結果表明該法線性關系良好。

2.3.6 回收率試驗

2.3.6.1 精密量取苯扎氯銨對照品溶液（Cat.No. 1051001，USP ROCKVILLE；MD Lot.LOD209；10%，W/V）1 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。

2.3.6.2 精密量取儲備液3 mL，置50 mL量瓶中，加陰性溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液，共平行配制3份。

2.3.6.3 精密量取儲備液2 mL，置25 mL量瓶中，加陰性溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液，共平行配制3份。

2.3.6.4 精密量取儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，加陰性溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液，共平行配制3份。照含量測定方法進行試驗，回收率結果見表1。

2.3.7 耐用性試驗 按上述含量測定方法,分別改變流速為1.8和2.2 mL/min、改變流動相比例為60∶40和52∶48以及改變柱溫為30℃、35℃和40℃對樣品（批號：090901）進行含量測定。結果表明該方法在流動相流速、流動相比例和柱溫變化方面的耐用性均較好，RSD也均符合規定。

2.3.8 相對保留時間的確定 取不同時間、不同條件下測定的苯扎氯銨 C12、C14、C16的保留時間，以C16的相對保留時間為1.00，計算各同系物的相對保留時間，結果見表2。

由表中結果可知苯扎氯銨C12、C14、C16的相對保留時間較為穩定，根據表中結果，將苯扎氯銨C12、C14、C16的相對保留時間定為約0.51、0.71和1.00。

綜上所述，方法學研究結果表明，該法可以準確測定硝酸毛果蕓香堿滴眼液中苯扎氯銨含量。

2.3.9 樣品的含量測定及含量限度的確定 根據上述確定的方法，對長期留樣36個月的3批樣品和新制備的1批樣品進行含量測定，結果見表3。3討論

3.1 由表3結果可知，新制備的樣品苯扎氯銨含量與投料量基本相符；但樣品在儲存過程中苯扎氯銨的含量有所下降，至36個月時降低約0.001 1%。苯扎氯銨為季銨類陽離子表面活性劑，是一種快速廣譜殺菌劑，低濃度對各種革蘭陽性和革蘭陰性細菌即有殺菌作用。滴眼藥防腐劑用量 0.005%～0.02%，其有效濃度為0.002%～0.001%[5]。而本品中苯扎氯銨的的含量為0.008%，長期留樣36個月的3批樣品中苯扎氯銨的含量仍在其有效濃度范圍內，表明硝酸毛果蕓香堿滴眼液使用該濃度的苯扎氯銨用作抑菌劑是可行的。

表1 含量測定的回收率測定結果

表2 苯扎氯銨C12、C14、C16相對保留時間測定結果

表3 樣品含量測定結果

3.2 因各生產廠家所用抑菌劑不一定相同，所以《中國藥典》（2010年版）二部項下硝酸毛果蕓香堿滴眼液質量標準[6]中未列入抑菌劑檢查項目。為保證產品在正常使用過程中的苯扎氯銨含量限度不低于最低抑菌有效濃度，特將苯扎氯銨含量限度檢查項列入本品質量標準。相關文獻資料[7]認為，國家食品藥品監督管理局會結合藥品審批另行頒發本品藥品注冊標準，該標準往往在藥典標準基礎上建立更為嚴格的質控標準，從而更好地保證藥品質量。為此，我們將苯扎氯銨含量限度檢查方法訂入標準。結合國內外滴眼液抑菌劑80%～120%的含量限度要求和該產品實際情況，確定硝酸毛果蕓香堿滴眼液的苯扎氯銨含量限度為0.006 4%～ 0.096%（g/mL）。該限度在苯扎氯銨有效濃度范圍內，能保證產品質量。

3.3 由于該法分析時間較長，因此建議使用長度為150 mm的氰基柱。

[1]白潔，楊興華，普明輝，等.貝美前列素滴眼液療效及經濟性評價研究綜述[J].中國執業藥師，2009，6（11）：28-31.

[2]陳祖基.實用眼科藥理學[M].北京：中國科學技術出版社，1993：348.

[3]寧黎麗.眼用制劑研發過程中應關注抑菌劑的合理使用和質量控制[J].中國藥學雜志，2007，42（23）：1836-1838.

[4]The United states Pharmacopeial Convention.USP 30-NF25[M]. Rockville：United states Pharmacopeial Convention，2006：1069.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知（化學藥和生物制品卷）（2005年版）[M].人民衛生出版社，2005：854-855.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）二部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：947.

[7]王平.藥品的質量控制與質量標準 [J].中國執業藥師，2008，5（7）：38-39.

Determination of Benzalkonium Chloride in Pilocarpine Nitrate Eye Drops

Huang Zhiyuan，Zhu Yanggen（Jiangxi Zhenshiming Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangxi Fuzhou 344000，China）

Objective： To determine the content of benzalkonium chloride in the pilocarpine nitrate eye drops by HPLC.Methods：The chromatographic column （Hypersil CN，150 mm× 4.6 mm，5 μm）was used，the mobile phase was 0.03 mol/L sodium dihydrogen phosphate solution （plus 1 mol/L sodium hydroxide solution adjusted pH value to 7.0）-acetonitrile （57∶43），the flow rate was 2.0 mL/min，the UV detection was at 214 nm，the column temperature was 35℃，the resolutions between benzalkonium chloride C12，C14，C16conformed to the stipulation.Results：The linear calibration curves of benzalkonium chloride were obtained within the range of 40～160 μg/mL，Y=12.228 1 X +6.881 4（r=0.999 9，n=6），the recovery was 99.7%～101.9%（RSD=0.66%）.Conclusion：The method is simple，fast and accurate，with a high sensitivity and good repeatability，and can be used for the content determination of benzalkonium chloride in the pilocarpine nitrate eye drops.

HPLC；Benzalkonium Chloride；Pilocarpine Nitrate Eye Drops；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.10.006

2011-12-05）

黃志元，男，工程師。研究方向：藥品研發與注冊。通訊作者E-mail：hzy.lxy@163.com