ARHⅠ和DAPK在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及意義

何瑞，袁志誠，湛利平，李巧玉

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002;2.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，由于具有很強(qiáng)的侵襲性，且與周圍腦組織沒有明顯的界限，目前多采用以手術(shù)為主，結(jié)合放、化療的綜合療法，但治療效果仍不容樂觀，人們一直在探索各種新的治療方法來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，從而提高治療效果［1］。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)正常腦組織與不同臨床病理分級(jí)的腦膠質(zhì)瘤組織中ras同源家族成員Ⅰ(aplysia ras homologⅠ，ARHⅠ)基因和死亡相關(guān)蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)基因的表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性，為臨床上對(duì)膠質(zhì)瘤惡性程度、臨床預(yù)后及復(fù)發(fā)等方面的判斷和分析提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

47例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本均取自本院神經(jīng)外科2009年6月至2011年12月手術(shù)切除標(biāo)本的冰凍蠟塊，其中男29例，女18例，年齡14～73歲，中位年齡38.5歲。10例正常腦組織均取自腦外傷減壓術(shù)患者。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或激素治療，所有病例均有組織病理學(xué)和(或)細(xì)胞診斷學(xué)依據(jù)。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，嚴(yán)格按照WHO(2000年)膠質(zhì)瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分類、分級(jí):Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)10例，Ⅲ級(jí)14例，Ⅳ級(jí)17例，全部病理切片均經(jīng)兩名以上有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師同時(shí)確診。

1.2 主要試劑及儀器

ARHⅠ兔抗人單抗原液和SP免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗人DAPK多抗原液購自武漢博士德公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括光學(xué)顯微鏡及光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)(Olympus公司)，石蠟自動(dòng)包埋脫水機(jī)(金華惠友儀器設(shè)備有限公司)，微波儀、顯微鏡、連續(xù)切片機(jī)(Leica公司)。

1.3 免疫組化染色

每例標(biāo)本取2張切片，采用SP法進(jìn)行染色。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。結(jié)果判定:隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，ARHⅠ和DAPK的陽性染色均以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，所有細(xì)胞按陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度分為4級(jí)。陰性(－)，隨機(jī)視野中無陽性細(xì)胞;弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)少于30%，著淺棕黃色;中度陽性(++)，陽性細(xì)胞數(shù)30% ～80%，著棕黃色;強(qiáng)陽性(+++)，陽性細(xì)胞數(shù)＞80%，著棕黑色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，ARHⅠ和DAPK蛋白在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)率比較均采用χ2檢驗(yàn)，兩者間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤中ARHⅠ蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，ARHⅠ蛋白在正常腦組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中隨著腫瘤分化級(jí)別的降低和惡性程度的增高ARHⅠ的表達(dá)相應(yīng)降低。ARHⅠ蛋白的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的著色。見圖1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析提示，隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，ARHⅠ蛋白的陽性表達(dá)率相應(yīng)降低，見表1。ARHⅠ在Ⅰ－Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤之間的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 ARHⅠ蛋白和DAPK蛋白在Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)(SP×200)Fig 1 Expression of ARHⅠ and DAPK in glioma of grade II and grade III(SP×200)

表1 正常腦組織和各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中ARHⅠ的表達(dá)Tab 1 Expression of ARHⅠin normal brain and glioma of all pathological grades

2.2 人腦膠質(zhì)瘤中DAPK蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，DAPK蛋白在正常腦組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中隨著腫瘤分化級(jí)別的降低和惡性程度的增高DAPK的表達(dá)相應(yīng)降低。DAPK蛋白的陽性表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的著色，見圖1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析提示，隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，DAPK蛋白的陽性表達(dá)率相應(yīng)降低，見表2。DAPK在Ⅰ～Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤之間的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表2 正常腦組織和各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中DAPK的表達(dá)Tab 2 Expression of DAPK in normal brain and glioma of all pathological grades

2.3 ARHⅠ和DAPK在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析證實(shí)，在47例腦膠質(zhì)瘤組織中，ARHⅠ有DAPK蛋白的陽性表達(dá)率之間呈顯著正相關(guān)(r=0.723，P ＜0.05)，即ARHⅠ表達(dá)越高，DAPK的表達(dá)也隨之增加。見表3。

表3 ARHⅠ和DAPK在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)的相關(guān)性例Tab 3 Relationship between the expressions of ARHⅠ and DAPK proteins in glioma tissues

3 討論

近年來的研究表明，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變，自噬作用是腫瘤細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞起保護(hù)作用，自噬活性的降低在乳腺癌和胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用［2－3］。研究已證實(shí)腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因的復(fù)雜演變過程。其中有兩類基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，一類是癌基因，另一類是抑癌基因。ARHⅠ是1999年由美國德克薩斯大學(xué)采用差異展示PCR(differential display PCR)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)ras家族中被報(bào)道的抑癌基因，又名NOEY2或ras同源基因家族成員I。Xu等［4］將人的ARHⅠ基因?qū)?FVB/B鼠體內(nèi)，證實(shí)ARHⅠ在腎臟、肌肉、肺、腦、心臟均有表達(dá)。研究證實(shí)卵巢癌中存在 ARHⅠ的低表達(dá)［5］。Bao等［6］發(fā)現(xiàn)感染含ARHⅠ基因的腺病毒載體的腫瘤細(xì)胞株，5天后30% ～45%的乳腺癌和5% ～11%的卵巢癌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。另外，有報(bào)道前列腺癌中存在廣泛的1p31缺失，而ARHⅠ基因正位于該區(qū)域［7］。上述研究結(jié)果表明，ARHⅠ是抑癌基因，它的缺失可能引起腫瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，ARHⅠ在正常腦組織中均有表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達(dá)率逐漸下降，與乳腺癌、卵巢癌組織中的表達(dá)情況類似。隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的上升，ARHⅠ的表達(dá)逐漸降低甚至出現(xiàn)陰性表達(dá)，提示ARHⅠ的表達(dá)缺失可能促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

DAPK基因的蛋白產(chǎn)物是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為160×103的Ca2+/CaM調(diào)節(jié)的蘇/絲氨酸激酶，能通過 TNF-α，F(xiàn)as、IFN-γ 等路徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并在腫瘤抑制中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。研究表明，DAPK在宮頸癌和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)的缺失［8－9］。胡禮炳等［10］發(fā)現(xiàn)正常膀胱黏膜上皮的DAPK基因的免疫組化染色呈強(qiáng)陽性，在膀胱癌組織中大多為陰性，少數(shù)為弱陽性染色。楊海艷等［11］發(fā)現(xiàn)DAPK在高分化子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯高于低分化子宮內(nèi)膜癌。本研究結(jié)果表明，DAPK蛋白在正常腦組織中均有表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達(dá)率逐漸下降甚至出現(xiàn)缺失，與宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌及膀胱癌組織中的表達(dá)情況類似。這說明在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中DAPK也發(fā)揮了一定的作用。同時(shí)本研究表明，隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的上升，DAPK的表達(dá)逐漸降低甚至出現(xiàn)陰性表達(dá)，提示DAPK的表達(dá)缺失，可能也促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展。

DAPK在自噬中發(fā)揮核心作用，當(dāng)微管相關(guān)蛋白1B(microtubule associated protein 1B，MAP1B)與DAPK結(jié)合為DAPK-MAP1B時(shí)，可介導(dǎo)膜泡和自噬小體的形成，激發(fā)自噬［12－13］，ARHⅠ通過上調(diào)自噬相關(guān)基因4，促進(jìn)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3-I裂解為自噬小體膜上的GFPLC3-II，直接參與LC3-II在自噬膜的定位與自噬小體的形成［14］。此外，兩者在自噬活性的調(diào)節(jié)中也相互協(xié)同［15］。DAPK可能發(fā)揮了自噬活動(dòng)的門控作用，既為ARHⅠ作用的發(fā)揮創(chuàng)造了條件又控制了自噬的啟動(dòng)。因此，ARHⅠ與DAPK共同參與自噬活性的調(diào)節(jié)與自噬小體的形成。本研究結(jié)果顯示，ARHⅠ和DAPK的表達(dá)水平均與膠質(zhì)瘤的分化程度有關(guān)，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，兩者表達(dá)水平均呈降低的趨勢(shì)，并且兩者呈正相關(guān)。提示ARHⅠ和DAPK在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起協(xié)同作用。其表達(dá)強(qiáng)弱可反映膠質(zhì)瘤的惡性程度。因此，同時(shí)檢測(cè)兩者的表達(dá)，有助于進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特點(diǎn)，為臨床工作中對(duì)膠質(zhì)瘤的形成模式、惡性程度、臨床預(yù)后及復(fù)發(fā)等方面的判斷和分析提供一種新思路，并有望作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后情況的生物學(xué)標(biāo)志物。

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