人自體血清支持臍血源HSCs和MSCs共培養研究

宋 克 東， 劉 天 慶＊， 殷 軼 群， 郭 文 華， 方 美 云，石 芳 鑫， 朱 麗 麗， 吳 筱 婷， 馬 學 虎， 崔 占 峰

（1.大連理工大學 化工學院 干細胞與組織工程研發中心，遼寧 大連 116024；2.大連醫科大學 附屬第一醫院 血液科，遼寧 大連 116011；3.大連醫科大學 附屬第一醫院 婦產科，遼寧 大連 116011；4.牛津大學 工程科學系 組織工程與生物處理中心，英國 牛津 OX1 3PJ）

0 引 言

對造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的不斷研究證明，其可以廣泛應用在基因治療、骨髓移植及腫瘤凈化等方面[1]，特別是HSCs移植可應用在癌癥患者放化療后的造血功能重建中.但是HSCs在臨床上卻沒有得到廣泛應用，原因之一就是干細胞數量有限[2，3]，對其進行體外規?；瘮U增是解決此問題的有效方法.另外，雖然HSCs移植對癌癥患者放化療后的生命質量有顯著的改善作用，但由此因短期內嚴重嗜中性粒細胞減少癥和血小板減少癥等所帶來的痛苦卻是絕大多數患者不可避免要承受的，因此改善細胞質量，降低這些并發癥的發生是十分必要的.

目前，已有研究證明了間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有體外支持造血發生的功能，同時在NOD/SCID小鼠的體內實驗中，也證明了在同時移植HSCs和MSCs的情況下，對小鼠造血功能的重建有加速作用[4].而且聯合移植自體的MSCs對于臨床乳腺癌患者在化療后進行的造血干細胞移植，同樣具有促進造血重建的作用，與此同時，還有助于降低伴隨HSCs移植而引起的并發癥的發病率.除此之外，MSCs也可作為細胞治療的種子細胞和基因治療的載體細胞.

HSCs可來源于臍帶血（umbilical cord blood，UCB）、骨髓及外周血等，相對于后兩者，來源于UCB的HSCs不僅富含更早期的造血干/祖細胞，同時具有采集和保存容易、免疫原性弱、對異源性抗原產生的抗體少、無腫瘤細胞污染、對供者無損傷及副作用、成熟性T細胞較少、CD34＋CD38－與CD34＋CD33－的比例較高、來源廣泛且移植過程中可以降低移植物抗宿主病（GVHD）發生率等諸多優點[5].另外，UCB中還含有MSCs，這就使得與臍帶血有關的干/祖細胞成為了研究的熱點.在同一個培養體系內使UCB中的HSCs和MSCs能夠同時培養與收獲，來發揮臍血庫所保存的臍帶血干細胞資源應用于臨床中的作用，由此帶來的深遠影響是毫無疑問的.

目前對于臍帶血來源的HSCs與MSCs共培養的研究報道尚少[5].本實驗室范秀波等，在不添加血清，只添加了細胞因子組合（SCF 15ng·mL－1，TPO 6ng·mL－1，G－CSF 1ng·mL－1，FL 5 ng·mL－1，GM－CSF 5ng· mL－1，IL－3 15 ng·mL－1），同時用AC膠珠包被基質細胞支持的條件下，將微載體與生物反應器相結合，對UCB－HSCs與UCB－MSCs在轉瓶及旋轉壁式生物 反 應 器 （rotating wall vessel bioreactor，RWVB）內的共培養進行了考察[6].實驗結果表明，在RWVB中的擴增效果是最優的，12d內CFU－Cs擴增了（5.1±1.2）倍；NCs擴增了（3.7±0.3）倍；CD34－CD45－CD105＋（MSCs）細胞擴增了 （13.9±1.2）倍；CD34＋CD45＋CD105－（HSCs）細胞擴增了（5.2±0.4）倍.另外，對骨髓來源的HSCs與MSCs的共培養研究也已處于起步階段.Chen等用培養基MeylocultTM，不添加血清，加入高劑量的細胞因子組合（SCF 50 ng·mL－1，IL－3 10ng · mL－1，IL－6 10 ng·mL－1），在RWVB內令骨髓來源的HSCs和MSCs分別成功擴增了8倍和29倍[7].但是，由于Chen等對HSCs與MSCs的共培養采用的是懸浮方式，在分離收獲HSCs與MSCs時存在一定的難度.此外，到目前尚未有采用臍帶血自體血清同時培養和收獲臍帶血中兩種干細胞方面的研究報道.

由于HSCs懸浮生長，而MSCs具有貼壁生長的生物學特性，要想模擬體內微環境實現HSCs和MSCs的共培養，必須兼顧兩者的生長特性，分別提供它們懸浮培養環境與動態貼附表面，將微載體與適宜的生物反應器結合是解決此問題的可行方法之一.因變性膠原包被的交聯葡聚糖（cytodex－3）微載體具有良好的表面貼附特性，在三維動態培養貼壁細胞方面受到了廣泛關注.另外，與應用普遍的胎牛血清（FBS）相比，使用同一份臍帶血中的自體血清不僅可以為細胞提供更好的營養物質，而且在收獲細胞后的臨床應用中，也可以避免胎牛血清等動物血清引起的免疫反應.

本研究使用同一份臍帶血的血清，不添加細胞因子，也無基質細胞支持，采用微載體技術，實現臍帶血來源造血干細胞（UCB－HSCs）與間充質干細胞（UCB－MSCs）的共培養，并實現培養后兩種細胞的分離.繼而考察人自體血清在不同含量（2.8%、5.6%、8.3%和11.1%）下對 UCB－HSCs和UCB－MSCs體外擴增的影響，同時將5%、10%、15%和20%的FBS作為參照，來確定血清的較優用量.

1 實驗材料和方法

1.1 實驗試劑及藥品

IMDM培養基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco；臍血源血清和PBS緩沖鹽溶液自配；人淋巴細胞分離液（Ficoll－Paque）購自瑞典Amersham Biosciences公司；DMEM （高糖）、地塞米松（Dexamethasone）、IBMX、β－甘油磷酸鈉、吲哚美辛、胰島素、維生素C、運鐵蛋白和亞油酸均購自美國Sigma；青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自大連美羅大藥廠；CCK－8試劑盒購自日本同仁化學研究所；FITC－抗人CD34、IL－3和 GM－CSF購自美國BD Biosciences公司.

1.2 UCB－MNCs的分離

人臍帶血采自大連市沙河口區婦幼保健院，使用前已經得到產婦及家人知情同意.臍帶血均取自健康產婦足月分娩或足月剖宮產的嬰兒，每次采集量為50～100mL.在15mL無菌離心管內加入密度為1.077g·mL－1的人淋巴細胞分離液4mL，用吸管輕輕地將臍帶血稀釋液（臍帶血與PBS緩沖鹽溶液按體積比1∶1混合稀釋）滴加到人淋巴細胞分離液液面上（人淋巴細胞分離液與臍帶血稀釋液的比例為1∶（1～2）），以2 500r/min離心25min.待離心結束，用吸管將中間白膜層吸取，獲得 UCB－MNCs（單個核細胞）.分離后的細胞用IMDM基礎培養基離心洗滌兩次（1 000r/min，5min），調整細胞密度備用.

1.3 臍血源血清的提取

臍血源血清的提取方法：將全血室溫下靜置1～2h后，離心（1 000r/min，15min），離心后上清即為血清，取上清于－20℃保存備用.這種方法的弊端是需要將臍帶血分成兩份，來分別提取血清和單個核細胞，而每份臍帶血50～100mL，所含單個核細胞為1×108cell左右，如果將其分成兩份一定會減少原代獲取的細胞數量，結果在一定程度上造成了寶貴的干細胞資源的浪費.有的學者[7]采用以下方法同時獲得了血清和單個核細胞：將離心取完血清后的沉淀物與培養基混合，然后使用甲基纖維素沉淀紅細胞，接著去上清離心再與淋巴細胞分離液混合，采用密度梯度離心獲取單個核細胞.采用這種方法，血清和單個核細胞雖然能同時獲得，但是過程中需要多次離心，并且從取得臍帶血到分離出單個核細胞的過程耗時過長，這些都會對原代細胞的質量產生一定的影響.

1.4 cytodex－3微載體的預處理

稱取100mg（干質量）cytodex－3微載體分別置于兩支15mL無菌離心管中，然后加入10mL新鮮的不含Ca2＋、Mg2＋的PBS緩沖鹽溶液，于37℃環境中孵育過夜.隔天棄去上清，用新鮮的PBS緩沖鹽溶液（不含Ca2＋、Mg2＋離子）沖洗兩次，再加入10mL PBS緩沖鹽溶液，于115℃、1×105Pa下高壓滅菌15min.滅菌后，在超凈臺內操作，先吸去上清，用IMDM培養基清洗兩次，隨后加入10mL IMDM培養基，置于4℃冰箱中備用.

1.5 細胞計數

使用細胞計數板（即血細胞計數板）計數接種前后細胞懸液中的細胞數量和細胞密度.

1.6 靜態培養

共采集7份臍帶血，分別提取人自體血清和單個核細胞，前6份接種培養條件如下.人自體血清培養：將從新鮮的臍帶血分離得到的UCBMNCs以2×106cells·mL－1的密度接種到24孔板（已提前鋪滿cytodex－3微載體）中，添加20%的同一份臍帶血來源的血清，于37℃、5%CO2、20%O2及飽和濕度條件下共培養12d.通過光鏡觀察，每隔24h計數.另將胎牛血清培養作為對照組，培養方法為將自臍帶血分離得到的UCB－MNCs按上述相同條件接種，在IMDM培養基中添加20%的FBS，作為對照組.

第7份接種方法如下：將自臍帶血分離得到的MNCs以2×106cells·mL－1的密度接種到已預先鋪滿cytodex－3微載體的96孔板中.實驗分8組進行，人自體血清（HAS）含量依次為5%、10%、15%和20%，FBS含量分別為5%、10%、15%和20%.每組均用10個孔，每孔100μL.每組實驗有3個平行組.每天取各組1個孔內的微載體，使用CCK－8試劑盒測定各微載體上細胞的活力值，并用細胞計數板測定該孔內細胞懸液的細胞密度.隔天為每孔補充10μL相應的培養基.取第3、6d的細胞懸液做CD34＋細胞流式檢測，并取第6d的微載體，來誘導分化成骨及成脂.

因為本研究提取的同一份臍帶血的血清是采用密度梯度離心后獲得的上層血清，而事先加入的PBS、抗凝劑等已將此血清成分稀釋，所以人自體血清的含量實際要偏低.通過換算得出培養基中的人自體血清的實際含量依次為2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.

1.7 CD34＋細胞的流式細胞儀分析

對擴增前后的細胞通過流式細胞儀（Becton Dickinson）進行CD34－FITC抗體檢測，分別檢測原代、第3d、第6d的CD34＋細胞含量.細胞標記方法如下：首先用PBS緩沖鹽溶液洗滌細胞1次，然后加入10mL的CD34－FITC抗體，于4℃下避光孵育30min.孵育結束后再用PBS緩沖鹽溶液洗滌1次，通過流式細胞儀分析CD34＋細胞的含量，用Mac OS 8.6軟件得出檢測結果.

1.8 CCK－8試劑盒測定細胞活性

選用CCK－8細胞活性試劑盒測定微載體上的UCB－MSCs細胞活性.每天小心吸出96孔板中對應孔的細胞懸液，用PBS緩沖鹽溶液沖洗孔底微載體，然后輕輕吹打，等到微載體沉降到孔板底部后，用移液器小心將上清吸出.如此重復2～3次后，加入100μL新鮮的IMDM培養基，再加入10μL CCK－8試劑，于37℃下孵育3h，吸出上清，用酶標儀檢測吸光度（OD）.

1.9 UCB－MSCs的多向誘導分化

將已培養6d的UCB－MSCs進行多向誘導分化檢測.其方法如下：小心將原培養基吸出，保留原孔內的微載體，用PBS緩沖鹽溶液沖洗1遍，等到微載體沉降后小心將PBS吸出，分別加入成骨和成脂誘導劑.在此過程中，每隔3d全量換液1次，連續誘導2周.在第1周進行成骨細胞的ALP染色，第2周進行脂肪細胞的油紅染色，第3周進行成骨細胞的von Kossa染色.成骨誘導劑：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋50μmol·L－1維生素C＋10mmol·L－1β－甘油磷酸鈉.軟骨誘導劑：IMDM＋0.1μmol·L－1地塞米松＋50μg·mL－1維生素C＋100μg·mL－1丙 酮 酸 鈉 ＋10ng· mL－1TFG－β3＋500 ng·mL－1BMP－6＋50mg·mL－1ITS.成脂誘導劑：DMEM＋10%FBS＋100nmol·L－1地塞米松＋200μmol·L－1吲哚美辛＋0.5mmol·L－1IBMX＋10μg·mL－1胰島素.成骨誘導ALP染色和von Kossa染色方法參見文獻[8，9].

1.10 數據的統計分析

實驗均選3次平行組，其中統計數據用“平均值±標準偏差”表示，采用t－檢驗來確定顯著性水平，用Origin7.5軟件進行處理.

2 實驗結果

2.1 原代UCB－MSCs的培養成功率

本研究共采集了7份臍帶血，其中有5份人自體血清培養組成功培養出UCB－MSCs，成功率約為71.4%.胎牛血清培養組中也有相同的5份成功培養出UCB－MSCs.而另兩份均未培養出UCB－MSCs，原因可能是其中一份臍帶血是過夜（24h）后操作的，細胞質量可能因此受到了一定的影響.

通過考察細胞在微載體上的貼附及生長狀態可以看出，同一份臍帶血來源的人自體血清（HAS），對 UCB－HSCs和 UCB－MSCs的體外擴增有很好的支持效果，由圖1（a）可以看出 UCBMSCs在cytodex－3微載體上的貼附生長狀態良好.

與20%FBS的培養效果（圖1（b））相比較，同一份臍帶血來源的人自體血清可以達到與之相同的培養效果.這說明11.1%含量的臍帶血人自體血清可以替代20%的FBS，在培養過程中支持UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附、伸展和生長.

在培養前6份臍帶血干細胞的過程中，采用計數板每24h統計懸液中的有核細胞（NCs）數，其密度變化如圖1（c）所示.由圖可以看出含量為11.1%HAS培養組和20%FBS培養組的密度變化情況基本是一致的，且11.1%HAS在120h時達到密度的最大值4.5×106cells·mL－1，而20%FBS在72h達到最大值3.5×106cells·mL－1，達到最大值后進入平臺期48h.二者無顯著性差異（p＜0.05）.

2.2 原代UCB－HSCs的CD34＋流式結果

原代細胞的CD34＋流式結果如圖2所示.其中實驗組的結果為加入CD34抗體的檢測結果，得出陽性率為1.1%；而空白對照組的結果為未加CD34抗體處理的檢測結果，得出陽性率為0.4%.兩圖陽性率之差即為原代細胞中的CD34＋細胞（UCB－HSCs）含量，約為0.7%.每份臍帶血原代共分離得到單個核細胞5.28×107cells，其中UCB－HSCs的含量為3.7×105cells.

2.3 UCB－MSCs在微載體上的貼附

培養10d后，在cytodex－3微載體上的UCBMSCs貼附形態如圖3所示.其中圖3（a）～3（d）為人自體血清培養組，血清含量逐漸遞增，分別為2.8%、5.6%、8.3%和11.1%.圖3（e）～（h）為作為對照的胎牛血清培養組，血清含量分別為5%、10%、15%和20%.從圖中可以看出，在8組實驗組中均有間充質樣細胞在cytodex－3微載體表面貼附，且伸展狀態良好.但在這8組中，微載體表面的細胞數量均略有不同，在HAS及FBS培養組中，隨著血清含量的增加，微載體表面的細胞數量都略有增加.

2.4 總有核細胞（NCs）的擴增

在培養條件為加入不同含量血清，同時隔天補液10μL的情況下，96孔板內懸液中的細胞密度變化如圖4（a）、（b）所示.從圖4（a）可以看出，當在培養基中添加HAS時，4組血清濃度不同時，對細胞密度變化帶來的影響并不大，只是隨著血清濃度的增加，細胞密度略有增加.各組細胞密度均在第4d達到最大值，分別為（2.9±0.1）×106、（3.2±0.25）×106、（3.5±0.4）×106和（3.9±0.1）×106cells·mL－1.由圖4（c）可以看出在培養的第4d，2.8%組 NCs擴增了（1.45±0.05）倍，5.6%組 NCs擴增了（1.58±0.13）倍，8.3%組 NCs擴增了（1.73±0.2）倍，11.1%組 NCs擴增了（1.95±0.05）倍.

圖1 含血清培養體系中UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附和NCs細胞密度變化情況Fig.1 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers and change of density of NCs cultured with serum

圖2 原代UCB－HSCs的流式分析結果Fig.2 Flow cytometric analysis of primary UCB derived HSCs

圖3 UCB－MSCs在cytodex－3微載體上的貼附形態Fig.3 UCB－MSCs adhered to cytodex－3microcarriers

圖4 不同血清條件下的NCs細胞密度變化和擴增倍數Fig.4 Density change of NCs and expansion fold of NCs cultured with different serum content

從圖4（b）中可以看出，在培養基中加入FBS時，其含量對于NCs的密度變化影響也不是很大，4組同樣均在第4d達到細胞密度最大值，依次為（3.6±0.53）×106、（4.0±0.25）×106、（3.7±0.17）×106和（3.97±0.2）×106cells·mL－1.但與 HAS組不同的是，細胞密度在FBS的含量為10%時最大，培養效果最好.由圖4（d）可以看出培養至第4d時，5%組NCs擴增了（1.8±0.26）倍，10%組 NCs擴增了（2.0±0.13）倍，15%組 NCs擴增了（1.85±0.08）倍，20%組NCs擴增了（1.98±0.1）倍.

比較兩種血清培養組中效果最好的細胞密度變化，也就是將11.1%HAS組和10%FBS組作對比，如圖5所示.可以看出10%FBS的細胞密度略高于11.1%HAS的，但兩者并無顯著性差異（p＜0.05）.

圖5 NCs的細胞密度變化曲線Fig.5 Change of the cell density of NCs

2.5 UCB－HSCs（CD34＋）的擴增

通過對原代、第3d及第6d細胞懸液中的有核細胞進行CD34＋細胞（HSCs）的流式分析，即可獲得血清在不同含量下的CD34＋細胞（HSCs）的擴增結果，如圖6所示.從圖6（a）中可以看出，HAS含量為5.6%時，對UCB－HSCs的擴增是最優的，且隨著培養時間的延長，CD34＋細胞（HSCs）的含量逐漸上升，最大擴增倍數為（1.88±0.33）倍.相比原代培養，其他組的CD34＋細胞（HSCs）的含量有所下降.從圖6（b）中可以看出，在FBS含量為10%時，培養效果最佳.但是，與HAS培養組不同的是，隨著培養時間的延長，此組的CD34＋細胞（HSCs）的含量先增加后下降，最大擴增倍數為（4.48±0.9）倍.

同樣比較了5.6%HAS和10%FBS培養下的CD34＋細胞（HSCs）擴增倍數，如圖6（c）所示.由圖可以看出相比5.6%HAS，在10%FBS時的培養效果更好.

2.6 微載體上UCB－MSCs活性分析

在血清含量不同的培養條件下微載體貼附UCB－MSCs的活性變化如圖7所示.圖7（a）、（b）添加的血清分別為人自體血清和胎牛血清.從圖7（a）可以看出，采用人自體血清培養時，各組的OD相差不大，11.1%組的OD比其他組的略高，但沒有顯著性差異（p＜0.05）.其中當HAS含量為11.1%且培養至第3d時OD最大，為0.56±0.07，當HAS含量為8.3%時，第7dOD最大，其余兩組在第4d達到最大值.從圖7（b）中可看出，用FBS培養的各組的OD相差也不大，20%含量的FBS培養組的值要略高于其他組，但也無顯著性差異（p＜0.05）.對于FBS培養組，隨著培養時間的延長，第4d達到最大值0.5±0.01.而其余3組培養都在第7d達到最大值，分別為0.48±0.04（5%）、0.53±0.07（15%）和0.6±0.1（20%）.

11.1%HAS與20%FBS組的OD變化情況比較如圖8所示.由圖可看出相比HAS組，FBS培養組的OD略高.將兩組OD的最大值進行t－檢驗，二者無顯著性差異（p＜0.05），如圖8（b）所示.

圖6 不同血清含量下的UCB－HSCs（CD34＋）的擴增情況Fig.6 Expansions of UCB derived HSCs（CD34＋）cultured with different serum content

圖7 不同血清含量培養條件下微載體上UCB－MSCs的活性變化情況Fig.7 ODof UCB－MSCs adhered to microcarrier cultured with different ontent serum

圖8 微載體上UCB－MSCs的OD比較Fig.8 Comparison of ODof UCB－MSCs adheredto microcarrier

2.7 貼附在cytodex－3微載體上細胞的多向分化潛能分析

UCB－MSCs應該具有向成骨、軟骨及脂肪細胞等多向分化的潛能，其中向軟骨方向的誘導需要大量間充質樣細胞.因為本研究自臍帶血分離得到的是原代UCB－MSCs，具有較少的細胞數量，所以沒有充足數量的細胞進行向軟骨方向誘導的研究.比較所有培養組中貼附于微載體的細胞誘導分化情況，結果發現它們之間的誘導分化無顯著性差異.

當成骨誘導1周時，進行了ALP染色，結果發現胞質內有黑褐色顆粒出現，培養細胞的誘導分化結果如圖9所示，這表明微載體上有細胞表達ALP.脂肪誘導2周時，進行了油紅染色，結果發現染色后各培養組中均未觀察到油滴的出現.對于UCB－MSCs是否有分化成脂肪細胞的能力說法不一，Kern等[10]作了相關方面研究，結果發現UCB－MSCs不能轉化成脂肪細胞.其將骨髓、臍帶血及脂肪來源的間充質干細胞向成骨、軟骨及脂肪等方向的分化潛能作了比較，實驗中11份臍血源間充質干細胞均未能表現出向脂肪方向的分化潛能.Kern等認為，間充質干細胞轉化成脂肪細胞能力與干細胞的老化程度有一定關系，脂肪細胞一般是存在于成人的骨髓和脂肪組織中的，在胎兒的骨髓中未能發現脂肪細胞.而Moerman等[11]研究發現隨著間充質干細胞的老化，其分化成成骨細胞的能力減弱而分化成脂肪細胞的能力增強.另外，Chang等[12]同樣認為 UCB－MSCs向脂肪方向的分化并不敏感.綜上可以得出，相比BM－MSCs等成體來源的干細胞，UCB－MSCs更為原始、更為早期，其向脂肪細胞分化的可能性也相對降低.

當成骨誘導3周時，進行了von Kossa礦化結節染色，觀察發現胞質內有鈣化基質形成，同時被AgNO3染成了黑色，如圖10所示.由于原代UCB－MSCs含量相對較少，發現微載體上黑色不是很明顯，但同樣可以確定為鈣化基質.

圖9 UCB－MSCs向成骨細胞分化的ALP染色Fig.9 ALP staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

圖10 UCB－MSCs向成骨分化的von Kossa染色Fig.10 von Kossa staining for osteogenic differentiation of UCB－MSCs

3 討 論

本研究采用同一份臍帶血來源的血清替代傳統的胎牛血清，進行了UCB－MSCs和UCB－HSCs的共培養實驗，結果從7份臍帶血中成功培養出5份 UCB－MSCs，UCB－MSCs在cytodex－3微載體表面呈長梭樣貼附，原代培養成功率達到71.4%，這與張勇剛[13]等的研究結果（71.2%）相近.

在96孔板的培養組中，考察了兩種類型血清（人自體血清和胎牛血清）及其不同含量對原代UCB－MSCs在cytodex－3微載體表面貼附及生長情況的影響，同時用流式檢測及細胞計數考察了同一體系下UCB－HSCs的擴增情況.結果表明，在96孔板培養體系中只添加血清的情況下，采用微載體技術可同時培養并收獲同一份臍帶血來源的UCB－HSCs和USB－MSCs，實驗結果也表明傳統的FBS可被從同一份臍帶血中提取的HAS所代替，且低含量的HAS培養基可以達到高含量的FBS培養基的培養效果.分析實驗數據得出，不同含量的血清對總有核細胞（NCs）的擴增倍數影響不是太大.另外，研究發現在 HAS組中11.1%的NCs擴增效果最好，在對照組FBS中10%含量的NCs擴增效果最好，但這兩組間并無顯著性差異（p＜0.05）.由流式檢測得出，5.6%HAS對 UCB－HSCs的擴增效果最好，而10%FBS對UCB－HSCs的擴增最優.從CCK－8檢測結果可以看出，貼附在微載體上的UCB－MSCs的擴增效果雖然都是隨著兩種血清含量的增加而略有提高，但各組間并沒有顯著性的差異，也就是說血清含量的影響并不是很大.所以，本文得出對于一次原代實驗中同時培養UCB－HSCs和UCBMSCs而言，HAS的用量為5.6%時效果最佳.

對于所有的培養體系，從懸液中的總有核細胞（NCs）密度變化的情況可以看出NCs的擴增效果并不佳，經過4d的培養，11.1%HAS組的NCs僅擴增了（1.95±0.05）倍，而10%FBS組則擴增了（2.0±0.13）倍.可能的原因如下：① 細胞接種密度高：由于自臍帶血分離獲得的UCBMSCs的量較少，一般為（0.05～2.8）個/106單個核細胞[14].由于采用高密度接種有利于原代UCB－MSCs在微載體表面貼附及成功培養，本研究接種的細胞密度為2×106cells·mL－1.在此密度下，細胞已經很難擴增.先前的學者在造血干細胞的擴增中采用稀釋換液，一般設定細胞的上限接種密度為1.5×106cells·mL－1[15].所以，只能采用相對較高的NCs接種密度才能在原代培養中同時獲得UCB－MSCs和UCB－HSCs，則兩種細胞在原代便難以獲得好的擴增效果.但在以后的傳代培養中可采用較低的接種密度及添加細胞生長因子等來獲得高的擴增倍數.② 培養體系?。捍舜窝芯坑玫氖?6孔板的靜態培養體系，只有100μL，容量過小，這同樣是細胞擴增效果不佳的影響因素之一.另外，靜態培養中營養物質分布不均、代謝產物無法及時排出等其他缺點也同樣制約著培養效果.

盡管本研究中UCB－HSCs和NCs的同時擴增效果并不理想，很多方面工作也需進一步優化，但由實驗可得出，采用同一份臍帶血來源的血清對UCB－HSCs和UCB－MSCs的體外擴增有很好的支持作用，這樣為干細胞在臨床上使用的安全性提供了保障.在今后的研究中可考慮采用三維動態培養系統，如轉瓶或旋轉壁式生物反應器等，因為動態反應器不僅可以提供較大的培養空間來提高細胞的擴增能力，而且還可以使營養物質的供給更加充分，由此提高細胞的擴增能力.

4 結 論

離心后得到的臍帶血來源的人自體血清可以代替傳統的胎牛血清，可支持 UCB－HSCs和UCB－MSCs的體外培養，為這兩種細胞提供營養成分.此外，HAS使得UCB－MSCs的原代培養成功率達到71.4%，同時支持其在微載體cytodex－3上的貼附、伸展與生長等特性.在只添加血清的96孔板培養體系中結合微載體技術可同時培養并收獲同一份臍帶血來源的UCB－HSCs和USBMSCs，且對于一次原代實驗中同時培養UCBHSCs和 UCB－MSCs而言，HAS的用量約為5.6%時效果最佳.

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